【学术笔记】生物大分子凝聚物相分离的热力学与动力学性质研究

【学术笔记】生物大分子凝聚物相分离的热力学与动力学性质研究

2022年04月21日上午，受北大-清华生命科学联合中心唐淳教授邀请，伊利诺伊大学芝加哥分校（the University of Illinois at Chicago）Huan-xiang Zhou教授在线上带来一场题为“Thermodynamics and dynamics properties of phase-separated biomolecular condensates”的精彩报告。

【概要】

生物大分子可通过相分离来形成凝聚物，并以此参与多种重要的细胞生理功能，部分凝聚物甚至与神经退行性疾病和肿瘤有密切相关，然而人们对这类生物大分子凝聚物的物理性质和复杂行为相关的研究才刚刚开始。在早期的研究中，Huan-xiang Zhou教授课题组首先发现生物大分子凝聚物的形成过程可以通过添加大分子组分来进行调节，这些大分子调节剂可以被分为三类，对凝聚物形成过程产生或促进或抑制的影响，这取决于它们与驱动凝聚物形成的组分的相互作用是由空间排斥主导、弱吸引或强吸引。他们还发现大分子组分之间的相互作用强度和结构致密性差异会导致凝聚相在空间和时间上的竞争，导致不同凝聚态之间表现出不同的融合速度。他们还使用光镊对生物大分子凝聚物进行定量表征，测量其弹性模量、粘性模量和表面张力，发现这些凝聚物表现出粘弹性而非纯粘性的特征，其中不同凝聚物的剪切松弛参数可跨越从毫秒到秒的时间尺度，可覆盖凝聚物融合到老化的整个动力学过程。这些研究有助于弥合生物大分子凝聚物的生物学和物理学之间的理解差距。在本次讲座中，Huan-xiang Zhou教授系统地介绍了他们课题组近期对生物大分子凝聚物的热力学和动力学特性的物理决定因素的理论和实验研究。

【精彩回顾】

一、大分子调节剂对生物大分子凝聚物形成的影响在早期对生物大分子相分离凝聚物的研究中，人们发现向体系里加入不同类型的调节元素会对相分离过程产生不同的影响，例如向γD-crystallin体系中加入PEG分子可以提高其临界温度T_C，促进了相分离发生¹；但如果向γD-crystallin体系中加入βB1-crystallin，则会降低临界温度T_C，抑制其相分离²；另外，固定Whi3蛋白浓度，向体系中加入低浓度CLN3 RNA可以促进其凝聚物形成，但将RNA浓度增加至高于一定浓度后，凝聚物将消失，即随RNA浓度增加可对相分离产生先促进再抑制的结果³。为什么不同的调节元素会有这样不同类型的调节效果？Huan-xiang Zhou教授课题组提出假说，认为调节元素和发生相分离的生物大分子之间的相互作用强度可能是产生不同效果的决定因素。为了验证这一假设，他们使用了Gibbs-ensemble模拟来确定双组分片状颗粒的相图，用以讨论调节元素对相分离行为的影响⁴。在他们的模型中，两种组分分别为P（驱动凝聚物形成的组分）、R（大分子调节剂）， P与P的结合强度为ε_PP=1，R与R的结合强度为ε_RR=0 (即R和R之间没有相互作用)，P与R的结合强度ε_PR则是模型中的重要变量，改变ε_PR数值的大小后看相分离行为会发生怎样的改变。当ε_PR=0时，随着R的浓度增加，临界温度T_C也增加，此时的R可以促进相分离发生（图1a）；当ε_PR=0.5或1时，增加R的浓度，临界温度T_C开始下降，说明此时的R会抑制相分离过程（图1b、c）；当ε_PR=1.35时，R的浓度从0.00增加至0.25，此时的T_C是增加的，但当R浓度从0.43增加至1.5，此时T_C下降，说明在这种ε_PR的条件下，R随着浓度增加可以表现出双重调节的效果（图1d）。
这样的现象是可以从物理角度得到解释的：当ε_PR=0时，P和R之间没有相互作用，加入更多的R将挤占分散相中更大的空间，通过体积排阻效应间接提高P在此条件下的相分离能力；随着ε_PR的增加，越来越多的R被募集到液滴相中，当ε_PR=0.5时，R可以被募集至P的液滴相中，但因为PR的结合强度较弱，使得液滴相中组分的相互作用下降，变得不稳定，因此抑制了相分离过程；当ε_PR=1.35时，R可以很好的被募集至液滴相中，当R浓度较低时，PR的相互作用强于PP的相互作用，R的引入可以稳定液滴相，促进相分离，但当R浓度较高时，液滴中也进入了较高浓度的R，由于RR之间没有相互作用，因此液滴变得不稳定，相分离被抑制。根据模型结果，他们绘制了图2所示的热图，描述了不同条件下R对P液滴形成的影响，并将这三类R分别定义为体积排阻因子、促进子和抑制子。至此，他们从模型和理论的角度对大分子调节剂的功能进行了阐述。接下来，他们也用实验对刚才的理论模拟进行了验证。在生物大分子凝聚物领域SH3₅-PRM₅被广泛地用于相关研究⁵，他们基于SH3₅-PRM₅的体系，分别向其中加入Ficoll 70、lysozyme和heparin，看这些物质对SH3₅- PRM₅相分离所需要的临界浓度产生怎样的影响⁶。从图3的结果中可以看到，Ficoll 70的加入可以有效降低临界浓度，促进相分离；加入lysozyme则会提高SH3₅- PRM₅的临界浓度，抑制相分离发生；低浓度的heparin可以降低临界浓度促进相分离，而高浓度的heparin会抑制相分离。从实验结果上看，Ficoll 70、lysozyme和heparin分别表现出体积排阻因子、促进子和抑制子的性质。接下来他们也用实验测定了这三类调节剂和SH3₅- PRM ₅的相互作用强度，如图4所示，他们用FITC标记了这三类分子，然后将其与SH3₅- PRM ₅体系混合，看到Ficoll 70基本不会进入SH3₅- PRM ₅的液滴，说明Ficoll 70和SH3₅- PRM ₅的相互作用强度非常低（图4A）；lysozyme则在分散相和液滴相中都有分布，说明其和SH3₅- PRM ₅有较弱的相互作用强度（图4B）；heparin则基本只分布在液滴相中，说明其和SH3₅- PRM ₅有很强的相互作用强度。这些结果进一步地印证了不同ε_PR表现出不同的促进或抑制的调节效果。
二、多相分离的形成因素将上述的lysozyme（L，带正电）、heparin（H，带负电）、SH3₅（S，带负电）、PRM ₅（P，带正电）系统按照S:P:L = 10:10:150 μM组合，提高H的浓度，可以看到凝聚物的形态从液滴型（droplet）变成了聚集型（aggregation），即使聚集型随着时间也会逐渐变成液滴状，但其内部的荧光分布有非常显著的差异——当H浓度较低时，H和S有较好的共定位，但当H浓度较高时，H会和S与L分离，而S和L有比较好的共定位，即此时S-L和H-P在液滴内部再次发生了相分离，产生了多相结构。

为了更好地理解这一过程，他们也使用上述模型对多相结构的形成进行了模拟。运用平均场理论，他们模拟了D、R双组分系统，D是相分离的主要驱动因子，D与D之间有较好的相互作用；R是相分离的调节因子，R和R之间也有较好的相互作用，模型中假定ε_DD=1，ε_RR=0.9。他们认为D和R之间的相互作用强度可能会改变多相结构的形成过程⁸。通过改变不同的ε_DR，他们发现存在一个临界强度，当ε_DR=1大于临界强度时，不管R的摩尔分数为多少，D和R都不会发生分相；但当ε_DR=0.8小于临界强度时，R则在D的液滴中再次发生相分离，形成多相结构。这个模型一定程度上可用来解释图5中的现象。
三、生物大分子凝聚物融合过程的性质表征通过相分离形成的生物大分子凝聚物具有融合的趋势。凝聚物之间相互融合的速度是其流动性的重要指标，而流动性往往也是细胞功能和疾病的关键。为了讨论凝聚物的融合过程，他们课题组使用光镊对凝聚物融合过程进行观察，发现图8所示的四种类型的液滴中pK-H的组合融合最快，P-H约比其慢2倍，S-P则慢约20倍，S-L慢约100倍（图8）。他们也用实验验证了四种液滴的大分子堆积密度是存在差异的，其中pK-H约等于P-H，小于S-P，更小于S-L2000，和融合速度的差异基本一致⁹。为此他们提出猜想，认为非结构化蛋白质或聚合物链松散且容易地重新排列，从而可以表现出快速的融合；相反，结构化的蛋白质结构域会结合得更紧密，并且在重排之前会破坏之前已有的结合，难以发生重排，所以才更难融合。这些结果对生物大分子凝聚物液滴的形成和老化过程提供了非常有价值的信息和方向。

综上，Huan-xiang Zhou教授课题组运用了模型模拟和实验观测对生物大分子凝聚物的形成机制、调节方式、融合过程等热力学和动力学过程进行研究，他们确认了分子间相互作用和生物大分子的结构紧凑型在控制凝聚物的热力学和动力学特性中起着关键作用，为整个领域提供了非常有价值的理论基础和实验方案，为进一步研究生物大分子的各项性质的生物学功能做好了准备。

参考文献：

1. Annunziata O, Asherie N, Lomakin A, Pande J, Ogun O, Benedek GB. Effect of polyethylene glycol on the liquid-liquid phase transition in aqueous protein solutions. Proc Natl Acad Sci U S A. 2002 Oct 29; 99(22): 14165-70. doi: 10.1073/pnas.212507199. Epub 2002 Oct 21. PMID: 12391331; PMCID: PMC137855.

2. Wang Y, Lomakin A, McManus JJ, Ogun O, Benedek GB. Phase behavior of mixtures of human lens proteins Gamma D and Beta B1. Proc Natl Acad Sci U S A. 2010 Jul 27; 107(30): 13282-7. doi: 10.1073/pnas.1008353107. Epub 2010 Jul 7. PMID: 20616077; PMCID: PMC2922160.

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