帮研网科研学术 2022-04-26 16:44
线粒体 DNA (mtDNA) 编辑为细胞系和动物中线粒体遗传疾病的疾病建模以及未来这些疾病的治疗铺平了道路。然而，支持 mtDNA 编辑的细菌胞苷脱氨酶 DddA 衍生的胞嘧啶碱基编辑器 (DdCBE) 在很大程度上仅限于 5'-TC 环境中的 C-to-T 转换（例如，TC-to-TT 转换），仅适用于生成所有可能的转变（嘌呤到嘌呤和嘧啶到嘧啶）突变的 1/8。
2022年4月25日，韩国基础科学研究所Jin-Soo Kim（音译，金镇洙）团队在Cell 在线发表题为“Targeted A-to-G base editing in human mitochondrial DNA with programmable deaminases”的研究论文，该研究该提出了可编程的 TALE 连接脱氨酶，由定制设计的 TALE 蛋白、分裂或催化缺陷的 DddA 变体和工程化的腺嘌呤脱氨酶组成，可诱导人线粒体中的靶向 A-to-G 编辑。定制设计的 TALED 在人体细胞中非常有效，可在各种线粒体基因的 17 个靶位点催化 A 到 G 的转换，编辑频率高达 49%。
总的来说，在短期内，TALED 将有助于在细胞系和动物中产生 mtDNA 突变以创建疾病模型，这是药物开发的重要步骤。在 mitomap 中列出的 90 个已确认的致病性 mtDNA 点突变中，其中 42 个（=47%）可以使用 TALED 在人类细胞系或模型生物中产生，从而实现 A-to-G 转换，而只有 9 个（=10%）的 可以使用催化 TC 到 TT 转换的 DdCBE 来诱导突变。从长远来看，具有更高效率和特异性的 TALED 可以为纠正胚胎、胎儿、新生儿或成年患者中引起疾病的 mtDNA 突变铺平道路，预示着线粒体基因治疗的新时代。此外，正如最近 DdCBEs 所示，编码植物中数百个基因的叶绿体 DNA（其中许多基因对光合作用至关重要）可以用植物兼容的 TALED 进行编辑，从而开启植物遗传学和生物技术的新篇章。
另外，2022年4月4日，博德研究所刘如谦团队在Nature Biotechnology 在线发表题为“CRISPR-free base editors with enhanced activity and expanded targeting scope in mitochondrial and nuclear DNA”的研究论文，该研究为了提高编辑效率并克服 DddA 严格的 TC 序列约束，使用噬菌体辅助的非连续和持续进化来进化具有改进活性和扩大靶向范围的 DddA 变体。DddA6 和 DddA11 大大提高了全蛋白碱基编辑的有效性和适用性。
2022年3月18日，中国农业科学院深圳农业基因组研究所左二伟、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉、上海脑科学与类脑研究中心/临港国家实验室胥春龙、上海交通大学章美玲共同通讯在 Cell Discovery （IF=11）在线发表题为“Mitochondrial base editor DdCBE cause substantial DNA off-target editing in nuclear genome of embryos” 的研究论文，该研究使用 GOTI方法，以评估 DdCBE 对 mtDNA 和核 DNA 修饰的脱靶效应。该研究首次展示了 DdCBE 在整个核基因组中导致数千个脱靶 SNV，这些 SNV 富含 C-to-T/G-to-A 转换，这是低保真碱基编辑器 BE3 产生的 SNV 数的两倍。总之，该研究发现DdCBE 对核基因组具有广泛的脱靶效应，强烈需要优化 DdCBE 以在 mtDNA 上进行特定的碱基编辑，特别是在用于治疗线粒体疾病之前（。
2022年2月1日，上海交通大学章美玲，李文及中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉共同通讯在 Cell Discovery 在线发表题为“Human cleaving embryos enable efficient mitochondrial base-editing with DdCBE” 的研究论文，该研究表明，DdCBE 是一种有效的碱基编辑器，可在人类胚胎 mtDNA 中诱导点突变，并且在 8 细胞胚胎中的效率要高得多。 鉴于旁观者和脱靶编辑特征，DdCBE 仍有待进一步优化用于未来的基础和治疗研究。
2022年2月1日，南京医科大学许争锋、沈斌及凌秀凤共同通讯在 Cell Discovery 在线发表题为“DdCBE-mediated mitochondrial base editing in human 3PN embryos” 的研究论文，该研究首次证明了在人类 3PN 胚胎中进行 DdCBE 介导的线粒体碱基编辑的可行性，表明在人类早期胚胎阶段进行致病性 mtDNA 突变校正的可能性。 理论上，DdCBE可以纠正mtDNA中的一系列致病性A ∙ T-to-G ∙ C突变，从而达到治疗效果。尽管在 3PN mtDNA 中检测到的脱靶编辑可能不足以产生表型，但当前的线粒体碱基编辑策略需要进一步优化以满足任何临床应用的需求。
2020年7月8日，博德研究所David R. Liu及华盛顿大学医学院Joseph D. Mougous共同通讯在Nature 在线发表题为“A bacterial cytidine deaminase toxin enables CRISPR-free mitochondrial base editing”的研究论文，该研究描述了一种细菌间毒素，将其命名为DddA，它可以催化dsDNA中胞苷的脱氨。该研究设计了无毒且无活性的split-DddA半分子：DddA分割的一部分结构域（转录激活子样效应子阵列蛋白）和尿嘧啶糖基化酶抑制剂的融合，产生了无RNA的DddA衍生的胞嘧啶碱基编辑器（DdCBE），可催化人mtDNA中的C•G到T•A转化，具有高靶标特异性和产品纯度。该研究使用DdCBEs建模人类细胞中与疾病相关的mtDNA突变，从而导致呼吸速率和氧化磷酸化的改变。不含CRISPR的DdCBE可以精确操纵mtDNA，而不是消除因被靶向核酸酶切割而产生的mtDNA拷贝，这对线粒体疾病的研究和潜在治疗具有广泛的意义。
人类 mtDNA 中的各种突变不仅与母系遗传的遗传疾病有关，影响至少全球140万的人，而且与衰老和与年龄相关的疾病（包括癌症和糖尿病）有关。在 mitomap (www.mitomap.org) 中列出的总共 95 个临床证实的致病性 mtDNA 突变中，点突变占绝大多数 (90/95 = 94.7%)，原则上可以使用碱基编辑器进行纠正单核苷酸转化。mtDNA 中的靶向碱基编辑是治疗这些线粒体遗传疾病以及在细胞系和动物中产生疾病模型的一种有前途的方法，但由于缺乏适当的工具和方法而受到阻碍。
工程核酸酶，包括锌指核酸酶 (ZFN) 和转录激活因子样效应核酸酶 (TALEN)，可被设计为选择性地切割突变 mtDNA，从而降低野生型和突变 mtDNA 分子混合物中的 mtDNA 水平，但不能用于纠正同质突变或诱导 mtDNA 中的从头突变。CRISPRs RNA 引导的碱基编辑器，广泛用于核 DNA 中的靶向单核苷酸转换，不适合 mtDNA 编辑，因为引导 RNA 不能传递到线粒体。
最近开发的 DdCBEs 由来自Burkholderia cenocepacia的分裂细菌间毒素 DddAtox、定制设计的 DNA 结合转录激活因子样效应器 (TALE) 和尿嘧啶糖基化酶抑制剂 (UGI) 组成，允许研究人员编辑细胞系中的 mtDNA 、动物和植物，但主要限于 5'-TC 环境中的胞嘧啶编辑。因此，目前可用的 DdCBE 可以纠正 90 个已确认的致病点突变中的 9 个（=10%）。
在人类 mtDNA 中实现靶向 A 到 G 转换的碱基编辑器可以纠正这 90 种致病突变中的 39 种（=43%），包括那些导致 Leber 遗传性视神经病变（LHON）、线粒体脑肌病、乳酸性酸中毒、中风样发作 (MELAS) 和 Leigh 综合征的突变。
在这里，该研究提出了可编程的 TALE 连接脱氨酶，由定制设计的 TALE 蛋白、分裂或催化缺陷的 DddA 变体和工程化的腺嘌呤脱氨酶组成，该酶催化腺嘌呤的水解脱氨作用产生肌苷，在复制过程中与胞嘧啶配对，用于人类 mtDNA 中 A:T 碱基对到 G:C 对的目标转换（即 A 到 G 转换）。
总的来说，在短期内，TALED 将有助于在细胞系和动物中产生 mtDNA 突变以创建疾病模型，这是药物开发的重要步骤。 在 mitomap 中列出的 90 个已确认的致病性 mtDNA 点突变中，其中 42 个（=47%）可以使用 TALED 在人类细胞系或模型生物中产生，从而实现 A-to-G 转换，而只有 9 个（=10%）的 可以使用催化 TC 到 TT 转换的 DdCBE 来诱导突变。
从长远来看，具有更高效率和特异性的 TALED 可以为纠正胚胎、胎儿、新生儿或成年患者中引起疾病的 mtDNA 突变铺平道路，预示着线粒体基因治疗的新时代。 此外，正如最近 DdCBEs 所示，编码植物中数百个基因的叶绿体 DNA（其中许多基因对光合作用至关重要）可以用植物兼容的 TALED 进行编辑，从而开启植物遗传学和生物技术的新篇章。
参考消息：
https://www.cell.com/cell/fulltext/S0092-8674(22)00389-0
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