老司机教你玩转小胶质细胞形态学分析

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小胶质细胞（Microglia, MG）是一种分布于大脑和脊髓的神经胶质细胞，占脑内所有细胞的10-15%【1】。作为脑内主要的神经免疫细胞MG网络横跨整个中枢神经系统。

MG对维持大脑正常功能至关重要，具有以下三个基本功能：

1. 参与持续感知环境变化的哨兵功能（sentinel function）；

2. 促进神经元健康和正常运行的管家功能（defense function）；

3. 以及响应这些变化和提供神经保护所需的防御功能（defense function）。

MG的形态与其功能密切相关。正常情况下静息状态的MG胞体较小、呈高度分枝状，均匀分布于整个脑实质。当脑内稳态被打破如中枢神经系统发生损伤或感染时，损伤的组织与周围的星形胶质细胞释放ATP至细胞外，MG上的ATP受体感知ATP后突起开始向损伤中心延伸同时其余突起回缩。

组织损伤的程度可能决定了MG转化为吞噬细胞并参与病灶清除的速度，例如MG通过P2Y6受体检测UDP会导致MG将损伤组织投入吞噬过程中，随后胞体也发生回缩最终发挥吞噬作用清除细胞碎片【2】。

因此对MG形态学分析可评价其活化状态，而MG活化状态又与脑内受损部位的严重程度有着密切的关系。曾经有师妹问我，为什么投稿时我统计了MG的数量来说明MG激活审稿人不认同？这是因为MG的数量变化不足以说明其激活状态。今天半夏就给大家分享一些MG形态学分析的常见指标与分析方法，帮助大家轻松搞定MG定量分析。

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小胶质细胞标志物

工欲善其事，必先利其器。要做好MG形态学分析首先需要好的标记抗体，那么哪些抗体可以用来标记MG呢？我们使用脑、肺血管单细胞数据库寻找特异性定位于MG的基因，数据库链接为：http://betsholtzlab.org/VascularSingleCells/database.html。

Group1勾选Microglia，Group2勾选除Microglia以外的所有细胞，点击Compare即可查找在MG特异性表达的基因：

富集在MG前23的基因如下：

其中就有被广泛用作小胶质细胞标志物的钙结合蛋白Iba1（基因名Aif1），此外近年表达于小胶质细胞表面的明星分子Trem2也在其中。使用脑、肺血管单细胞数据库验证Aif1不同细胞类型的表达如下：

对于抗体购买推荐使用CiteAb（https://www.citeab.com/search）根据引用次数进行查找。

2

小胶质细胞成像技巧

好的图像是形态分析的基础。MG高度分支且不在同一平面，因此很难在单一焦平面将单个MG的完整形态拍清楚：

最佳成像方法为使用冰冻切片将脑片切至20-30μm，进行免疫荧光染色后使用共聚焦进行Z stack层扫，得到具有三维立体的MG【3】：

石蜡切片的厚度一般在4～6μm，为更好的保存MG的完整形态不建议使用石蜡切片。人类蛋白组图谱（https://www.proteinatlas.org/）中查询Aif1，石蜡切片的MG形态呈碎片化：

那么，免疫组化是否不适合MG形态学分析呢？也不是，半夏曾经使用免疫组化获得过背景干净、形态完整的MG，效果如下：

经验如下：

1. 一抗孵育时间为36-48h；

2. 缩短DAB显色时间，即显色时肉眼观察无明显着色；

3. 使用Olympus进行多层扫描后进行扩展景深处理。

附，景深扩展功能为Olympus（sv120）显微镜自带功能，可轻松为超出焦深的样本生成图像。手动景深扩展功能可以连续调整焦距从而在Z轴上组合多幅图像并将其作为单一图像输出。

3

小胶质细胞形态学分析

1. 二维分析指标

1.1 Area（面积），MG density为cell number/100μm2。值得注意的是MG计数标准为计算有胞体的MG数量，碎片化的突起无法计数。

1.2 Branches（分支点数目）：MG分支点的数目。

1.3 End-point voxels（分枝末端的数目）：MG分枝末端的总数。

1.4 Average Branch Length（突起平均长度）：突起总长度除以突起数目。

1.5 Maximum Branch Length（最长突起长度）：所有突起中最长的突起的长度。

1.6 Branch Length（分支长度）：每个分支的长度。

指标1.1-1.6基于MG激活过程中突起回缩，ImageJ分析上述指标请参考往期推文：ImageJ小胶质细胞形态学分析，基本步骤为MG图像进行二值化与骨骼化后使用AnalyzeSkeleton（2D / 3D）插件分析骨架【4】。

1.7 Solidity（坚固性）：细胞面积/突起面积。

ImageJ -> Set Measurements下勾选Shape descriptors后结果中有Solidity指标。

1.8 对MG进行 Sholl analysis。Sholl Analysis不仅是分析神经元复杂性的经典方法，也可以用来分析MG的复杂性（例如统计Maximal intersection）。Sholl Analysis以细胞胞体为圆心（不包括胞体）画一系列同心圆，得到随离胞体距离变化的突起交点（Intersections/Crossings）个数，以此来反映细胞的复杂性,MG激活过程中突起复杂性降低。

ImageJ/Fiji自带Sholl Analysis插件，如使用普通ImageJ可于http://fiji.sc/Sholl处下载插件。

分析步骤：

（1）ImageJ软件打开MG，Image -> type -> 8-bit将转换为8-bit灰度。

（2）Process -> Filters -> Unsharp Mask增加对比度（右图）：

（3）Image -> Adjust -> Threshold选中MG，Apply进行二值化：

Process -> Noise -> Despeckle去除噪点：

（4）使用直线工具以MG胞体中心为起点向最长突起处画直线：

Analyze -> Sholl -> Deprecated -> Sholl Analysis，进入Sholl Analysis参数界面：

Definition of Shells设置开始Sholl分析的半径（即胞体的大小），Ending radius为最长突起的位置即Sholl分析结束的半径，Radius step size为两个分析半径之间的步进：

Output Options可以设置导出结果，包括Intersections mask与显示在分析图像上显示交点与同心圆：

得到如下结果：

左侧的Intersections mask为伪彩，颜色深浅代表交点数。点击Analyze -> Tools -> Calibration Bar可以添加Color bar，设置bar位置（Location）、颜色、字体大小等，点击OK可见最多交点为20个：

Sholl Analysis还可以得到SCI论文中常见的交点统计图，点击List可查看并保存数据：

上图每个小十字架为对应分析半径的实际交点数目，蓝色曲线为对2D distance与交点数目进行多项式拟合的曲线。R2为拟合曲线与散点的相关性为0.824，右上角其他数据解释如下：

指标

含义

Max

实际交点数最大的位置。

Nm

临界值，即拟合曲线最高点对应的交点数，对应的Sholl半径为临界半径rc。

Nav

指所有交点的平均值。曲线中心的x为分析形状的质心所在位置。

RImax

实际交点数最大值与Starting radius交点数目/分枝数的比值。

RINm

交点临界值交点数与Starting radius交点数目/分枝数的比值。

扩展：

除对进行二值化后进行Sholl分析外，还可对追踪重建的神经元进行Sholl Analysis，此方法同时可以得到突起的长度。使用功能为Fiji下Plugins -> Segmention -> Simple Neurite Tracer。

此外，NeuronJ插件也可以用来追踪突起长度。NeuronJ下载链接为：https://imagescience.org/meijering/software/neuronj/ 。将下载文件放至Plugins文件夹中，重启软件后在ImageJ软件Plugins菜单中即可找到NeuronJ插件。

2. 三维分析指标

2.1 Volume（体积），对应二维指标为MG的面积（Area），吞噬状态的MG体积减小。

ImageJ打开层扫Stack，Plugins-> 3D Viewer -> Display as Volume，即可查看的三维效果图：

后续可以使用Analyze -> 3D Objects Counter计算体积。Threshold调节阈值选中不同Slice中的目标，红色代表选中。Slice代表当前切片，Size filter根据最大值与最小值筛选目标：

点击OK得到体积、表面积等指标：

2.2 Sphericity index（球度），在3D图像创建后用Imaris软件可以实现计算。

形态学指标能够很好的反映MG功能状态的改变，指标众多，挑选最为自己所用的指标进行分析统计，有助于加强文章的说服力，希望对大家有所帮助，祝大家早日发文章！

参考文献：

【1】 Lawson LJ, Perry VH, Dri P, Gordon S.Heterogeneity in the distribution and morphology of microglia in the normaladult mouse brain. Neuroscience. 1990;39(1):151-70. doi:10.1016/0306-4522(90)90229-w. PMID: 2089275.

【2】 Nayak D, Roth TL, McGavern DB. Microglia development and function. Annu Rev Immunol. 2014;32:367-402. doi: 10.1146/annurev-immunol-032713-120240. Epub 2014 Jan 22. PMID: 24471431; PMCID: PMC5001846.

【3】 Otxoa-de-Amezaga A, Miró-Mur F, Pedragosa J, Gallizioli M, Justicia C, Gaja-Capdevila N, Ruíz-Jaen F, Salas-Perdomo A, Bosch A, Calvo M, Márquez-Kisinousky L, Denes A, Gunzer M, Planas AM. Microglial cell loss after ischemic stroke favors brain neutrophil accumulation. Acta Neuropathol. 2019 Feb;137(2):321-341. doi: 10.1007/s00401-018-1954-4. Epub 2018 Dec 22. PMID: 30580383; PMCID: PMC6513908.

【4】 Young K, Morrison H. Quantifying Microglia Morphology from Photomicrographs of Immunohistochemistry Prepared Tissue Using ImageJ. J Vis Exp. 2018 Jun 5;(136):57648. doi: 10.3791/57648. PMID: 29939190; PMCID: PMC6103256.

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