2022/3/30 9:25:23 阅读：887 发布者：chichi77
去年的小教程中，我们介绍了如何用在线工具初探自己研究的基因是否跟某些肿瘤的免疫浸润是否有相关性呢。
那么，如何从从公司拿到的RNAseq结果自己推测肿瘤标本里的免疫细胞浸润呢？掌握了这门手艺，不但可以深入挖掘自己的数据，丰富论文内容，也可以使得普通的RNAseq变成一个极具性价比的技术，毕竟价格只是单细胞测序的几十分之一。当然，如果自己连测RNAseq的钱都没有，也可以挖掘GEO等数据库的RNAseq数据，分析一下免疫浸润，结合自己感兴趣的基因，寻找课题思路。
拿到委托公司或者测序平台的肿瘤标本RNAseq结果，一般会提供基因count、RPKM以及TPM等表格，这些数据已经足以让我们自己在线分析免疫细胞比例的情况。今天介绍四个在线的工具：TIMER2.0，TIP，EPIC以及mySORT。做分析时最好四个都跑一下，相互对比，以获取更加稳定的分析结果。需要注意的是，使用这些工具发论文的话，要记得引用软件的原始论文，下面也会把论文信息一并奉上。此外，这些软件也调用一些具体的算法，比如XCELL，也要记得把原始算法对应的论文也一并引用。下面开始介绍具体使用流程。
（1）TIMER2.0
网址：http://timer.cistrome.org/
论文：Taiwen Li#, Jingxin Fu#, Zexian Zeng, David Cohen, Jing Li, Qianming Chen, Bo Li, and X. Shirley Liu. TIMER2.0 for analysis of tumor-infiltrating immune cells. Nucleic Acids Research 2020
进入网站后，点击Estimation
进入分析界面后，上传文件，注意此处需要Normalized TPM文件，而且是没有log转换过的。如下的常规matrix格式
选择肿瘤类型，列表里没找到的话选AUTO，点击RUN！
然后会看到右下角的分析状态，一顿操作！
分析后得到结果
首先是详细的表格，可以检索，也可以下载到本地自己折腾，包含了多种算法的结果，包括TIMER, CIBERSORT, quanTIseq, xCell, MCP-counter (or mMCP-counter for mouse) 和 EPIC等。
下面也展示了部分图示化的结果，更直观地展示了免疫细胞比例，以及在不同标本中的对比情况。个性化的作图，还是自己针对上面的表格自己制作更加合适。
（2）TIP
网址：http://biocc.hrbmu.edu.cn/TIP/index.jsp
论文：TIP: A Web Server for Resolving Tumor Immunophenotype Profiling. Cancer Research. 2018.
进入主页后点击Analysis
上传数据，选择肿瘤类型等，跟TIMER2类似。这里的原始数据可以是count也可以是TPM，但也不能是log转换后的。
Submit后一顿操作得到结果，比TIMER2漂亮很多
得到不同标本中免疫细胞的浸润情况，还附送一个signature gene expression结果，点击download data可以下载到这些对应的原始数据。
（3）EPIC
网址：http://epic.gfellerlab.org/
论文：Racle, J., Jonge, K. de, Baumgaertner, P., Speiser, D.E., and Gfeller, D. (2017). Simultaneous enumeration of cancer and immune cell types from bulk tumor gene expression data. eLife, 6, e26476.
这个网站相对简陋，进入主界面，直接可以分析，
选择数据后和参数后，点击Run
会得到详细的table结果，以及图示化结果，除了每个标本的免疫细胞比例情况，还有每种免疫细胞和不同标本的总体比例对比情况。
（4）mySORT
网址：https://symbiosis.iis.sinica.edu.tw/mySORT/
论文：Chen, S.; Yu, B.; Kuo, W.; Lin, Y.; Su, S.; Lu, I.; Lin, C. mySORT: A Web Framework by using Deconvolution Approach to Estimating Immune Cell Composition from Complex Tissues. Preprints 2020, 2020110385 (doi: 10.20944/preprints202011.0385.v1).
截止到目前（2021-11-07），此论文还没有完成审稿，因此目前的结果仅供参考，论文正式发表后可以使用。
进入主页后，
上传数据，比较友好的可以接受还没有normalization的数据。此处以示例数据展示结果，点击Submit，下面的表格中一顿操作。得到详细的table结果和几个可视化结果。
对于每个标本里的免疫细胞比例，除了展示具体比例构成外，还会做个聚类展示样本之间的关联相似程度。
再次提示，使用这些在线工具发表论文时，一定要记得引用对应的文献，如果涉及到具体的算法，也要一并引用里面的算法对应的论文。这样既保证自己论文的严谨性，也尊重他人的劳动成果。
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