关于测序那些坑，这份避坑指南必须收藏！

说起测序，大家都不陌生！从转录组，到代谢组、蛋白组、甲基化、磷酸化，又或是单细胞、空间转录组、基因组、eccDNA。测序种类眼花缭乱，总有一个你心动。但在实际取样和确定分组的时候，部分测序公司销售由于缺乏课题整体把握性，只想着赶紧成单，带来了一些潜在隐患。不测不知道，测完发现自己站在了月球表面（处处是坑）！

小编来带你盘点一下经常收到粉丝吐槽的几大经典坑！

一、样本少没关系，再少也能发文章？

作为经典坑之一，听信了鬼话收集一两对样本也去测转录组的朋友，已经哭晕在厕所。本就不多的经费，浪费之后更加雪上加霜。那么样本数少，为什么难以发文章？自测不是有创新性吗？为什么审稿人不待见，二次分析也困难重重呢？原因很简单，转录组RNA的抽提不止对样本克重有要求，样本数量直接决定了是否有统计学意义。例如大家常听的WGCNA加权基因共表达网络分析，至少需要15个样本。而样本数越少，网络的噪音也就越大。有些统计方法对样本量是有特殊要求的。而严谨一些审稿人，自然会对分析的准确性有一定要求，样本数少，准确度差，甚至没有湿实验验证，测序的优势也就荡然无存了！

二、分组设计不重要，测序类型最关键？

听信鬼话之二的朋友们，更是饱尝了劳力伤财的苦楚。好不容易下决心用一大笔经费测序，结果只在数量和热门测序类型上做对了选择，而分组实验设计这个决定文章科学问题的重头戏却忽视了。分组分的差，不仅浪费钱做一些无用组别，也会极大削弱选题的创新性！请跟我大声朗读：不测贵的，只测对的；贵而不对，等于浪费！

三、做测序送分析，帮你省去二次分析？

听起来很有诱惑力呢，毕竟二次分析费用似乎不菲，测序真的可以一举两得？清醒一点啊！世上没有免费的馅饼！你真的以为3分朝上的文章里都是用的测序公司送的分析图吗？（灌水一两分的，可以赌一赌）大多数测序公司的生信数据处理，采用流程化的云平台。足够方便，但不够个性！分析内容模块的多样化，参数调整的灵活化、联合数据库的丰富化，配色的定制化，你能想到的，测序公司的分析都 没 有 ！（事实就是这么无情和残酷~）有投稿经验的朋友都知道，一篇文章修回需要修图或补分析是再常见不过的了，但是测序公司送的馅饼你还要求加个蛋？不存在的！

好了，说完了坑，

接下来开启正确的打开方式！

一篇文章就犹如一个故事，故事根据是否有吸引性可读性所以有好坏之分，而生信类文章的故事好坏则取决于产生数据的实验设计方案：包含样本分组（决定了文章所能解决的科学问题是什么）；取样部位（决定了分析结果的可信度及临床应用价值）；技术手段（决定了可以从什么维度对所关注的科学问题进行阐释）。某一研究方向生信类文章的第一个吃螃蟹的人，必然离不开自己重金测序数据的支持，有了数据再加上个性化生信分析的加持，好文章也就到手了！无图无真相，接下来我们以案列的形式来瞅瞅自测如何助力作者吃到大螃蟹的~~

案列一

研究背景：对移植瘤的临床前研究表明免疫治疗具有高治愈率，然后大量的临床试验表明免疫疗法不能治愈大多数患者，即大多数临床前免疫治疗研究利用的是移植肿瘤模型，这高估了患者的反应。

自测数据神助攻：作者通过对免疫治疗前后的小鼠移植瘤和原发肿瘤样本进行单细胞测序，基于对所得到的测序数据进行分析，探究了移植瘤和原发肿瘤在免疫环境上的显著差异。最终发现小鼠移植瘤而非原发肿瘤中CD8+ T细胞和PD-L1+巨噬细胞的激活，而这些细胞存在于对PD-1免疫检查点治疗有响应的人类肉瘤。这些结果表明，具有类似移植肿瘤免疫表型的肉瘤患者可能最受益于PD-1免疫治疗。

编者按

对于肿瘤类生信文章，目前比较热门的研究方向之一是基于单细胞测序技术探究肿瘤免疫治疗响应的机制（值得被关注的科学问题加新兴的技术手段再加上数据分析出的有理有据的结论，有什么道理不是好文章好故事呢？）。

正如这篇单细胞测序与肿瘤免疫治疗的综述中所总结的，通过对单细胞测序数据进行分析，可以获取肿瘤微环境中的免疫细胞/基质细胞具体细胞类群的异质性信息，若入组样本可以根据反应进行分层，即可详细分析反应和抵抗的机制。而通过传统技术识别细胞群或标记物实现治疗监测，则可在更大的临床治疗范围内实现个性化治疗并改善病人预后。来自肿瘤微环境内部的发现也可能与外周循环的变化有关，而外周血样本则更适合进行定期监测。

案例二

研究背景：在超急性期诊断脊髓损伤(SCI)的严重程度对于患者的急诊临床护理是非常重要的。脊髓损伤的诊断性生物标志物的缺乏是导致临床结果不佳的主要原因。

自测数据神助攻：作者对脊髓损伤组/健康对照组/非中枢神经系统损伤的创伤对照组的外周血样本进行了转录组测序。基于差异分析筛选了仅在脊髓损伤组中有差异的基因作为脊髓损伤相关基因，进一步基于基因表达与脊髓损伤严重程度间的变化趋势，筛选了与脊髓损伤严重程度相关的基因，并分别进行LASSO预测模型构建，进而得到了针对不同脊髓损失风险程度的最优预测组合。

编者按

对于非肿瘤类生信文章，目前比较热门的研究方向之一是基于血液标志物对疾病的发生发展等进行诊断（将生信分析的落脚点放在临床问题的解决上，怎能不受审稿人青睐呢？）。

编者按

不管是基于单细胞测序技术探究肿瘤免疫治疗响应的机制，还是基于血液标志物对疾病的发生发展等进行诊断，不难发现，想成为某一研究方向生信类文章的第一个吃螃蟹的人，都要有重金测序数据的支持，以及正确打开螃蟹的方式：新颖准确的测序设计方案！

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