如何做好“蛋白表达”？
2024/2/1 16:25:25 阅读：160 发布者：
背景介绍：在蛋白表达系统的相关研究中，从头合成蛋白质并不是一个可行的选择。因此需要借助活细胞或细胞器用作生产和构建蛋白质的工厂。利用基因重组技术将特定基因的DNA序列作为模板生成蛋白质，被称为重组蛋白。其原理是将目的基因通过电转化或者热激等手段转入合适的宿主中，利用宿主的特定生理、生化和遗传特点进行目标蛋白大量表达及纯化的生物技术。广泛应用于结构研究、生物治疗、药物开发等。本篇推文将从蛋白表达载体的构建到如何提高蛋白的表达效率以及表达宿主如何选择来进行介绍，希望给做蛋白表达的初学者提供一些帮助！
蛋白质的产生
蛋白质合成的步骤，遗传信息储存于 DNA中，以此为模板经转录生成信使 RNA，mRNA编码的信息随后被翻译成氨基酸序列形成蛋白质(图1)。真核与原核生物转录和翻译有一定区别。原核生物中转录和翻译是同时发生的。转录产生的信使RNA不需要剪切、拼接等，真核生物转录在细胞核中进行，翻译在细胞质中进行，该过程是存在空间分隔的且有顺序发生，翻译后通过多种方式对多肽进行修饰，形成蛋白质结构。
蛋白表达载体的构建
通常来说，典型的蛋白质表达载体需包括以下主要元件：
• 多克隆位点 (MCS) ；
• 目的基因表达框：包括启动子和基因终止或 poly (A) 信号 ；
• 细菌的复制起始点 (ori) ；
• 宿主的抗生素筛选标记：如嘌呤霉素(puromycin)、新霉素(neomycin)和杀稻瘟菌素（blasticidin) ；
• 大肠杆菌的抗生素筛选标记：如氨苄青霉素（Ampr）、氯霉素（Camr）、卡那霉素（Kanr等；• 表位标签等 。
表1. 重组蛋白表达系统中常用的组成型和诱导型启动子
宿主 | 组成型启动子 | 诱导型启动子 |
哺乳动物 | CMV ；EF-1α；UbC；SV40 | 含Tet On的启动子；GAL4-USA |
大肠杆菌 | T7 | Lac |
昆虫 | Ac5；p10； | MT |
酵母 | GAP | GAL1；AOX1 |
蛋白标签是重组蛋白制备过程中与目的蛋白融合表达的蛋白或多肽，标签蛋白的作用一般有：促进目的蛋白的可溶性和稳定性；便于目的蛋白被检测；便于目的蛋白纯化。随着研究的需求和技术的发展，各种标签应运而生，多样化的标签可以满足不同的实验目的。
表2. 常见的蛋白检测标签
标签 | 应用说明 |
His | 对目的蛋白的空间结构影响极小，一般无需切除也不会对目标蛋白功能产生太大影响。 |
HA | 源于流感病毒的红细胞凝集素表面抗原决定簇，对目标蛋白的影响较小。 |
c-Myc | 来源于人类原癌基因Myc，由于可获得高特异性Myc单克隆抗体，因此在Western blot，免疫荧光和免疫沉淀中被广泛使用。但很少用于蛋白纯化。 |
Flag | 包含肠激酶的识别位点，方便去除，适合融合在目标蛋白N端。亲水性高，通常不会使与其连接的蛋白质失活，常用于真核表达系统中目标蛋白的检测。 |
3×Flag | 可免疫原性和与抗体的亲和性得到极大增强，适用于真核生物低水平表达的蛋白的检测和纯化。 |
S | 通常将 S-tag 构建到目标蛋白的 N 末端或 C 末端上，可以使用商业化的 S-tag 抗体进行免疫检测。 |
T7 | T7标签，一种源自T7噬菌体衣壳蛋白的表位标签，可购买商业化的Anti－T7抗体检测。T7标签常用于蛋白质印迹实验。 |
V5 | V5可融合到目标蛋白C端，常用于哺乳动物和昆虫细胞表达系统蛋白质印迹，免疫荧光和免疫沉淀检测。 |
表3. 蛋白纯化标签及应用
标签 | 应用和纯化方式 |
His | 组氨酸残基侧链与固态的镍有强烈的吸引力，可用于固定化金属螯合层析(IMAC)，对重组蛋白进行分离纯化。 |
GST | 该表达系统表达的GST标签蛋白可直接从细菌裂解液中利用含有还原型谷胱甘肽琼脂糖凝胶亲和树脂进行纯化。 |
MBP | MBP（麦芽糖结合蛋白），是大标签，分子量大小在40kDa以上，由大肠杆菌K12的malE基因编码。MBP可增加目标蛋白在细菌中的溶解性，尤其是真核蛋白，也可以增加融合蛋白表达量。融合蛋白可通过交联淀粉亲和层析一步纯化。 |
SUMO | 一种小分子泛素样修饰蛋白，可作为融合标签，不但可以提高融合蛋白的表达量，且具有抗蛋白酶水解以及促进目标蛋白正确折叠，提高重组蛋白可溶性等功能。该标签主要用于改善目标蛋白的表达，并非常用的纯化标签，要用于纯化可采用双标签。 |
CBD | CBD和一个来源于酵母的intein蛋白质组成一个双效的融合标签。融合表达产物在挂上亲和层析柱后只需要在低温（4℃）条件下用含DTT或者巯基乙醇，或者半胱氨酸的溶液洗脱，即可将目的蛋白洗脱，而将融合标签留在纯化柱上，而还原剂的小分子可以非常简单的去除。 |
Strep-tag II | Strep标签融合蛋白与链霉菌抗生物素蛋白柱上的基质特异性结合，D-生物素或其衍生物可作为洗脱剂，从而实现融合蛋白的特异性纯化。 |
提高蛋白表达的策略
密码子优化：选择最合适的表达载体，构建时进行密码子优化，使蛋白质在宿主内表达更完全；
提高蛋白溶解度：
①调节表达条件参数：优化培养基的浓度、pH值、类型甚至是批次或批号，还可向培养基中添加特定的试剂，例如生长因子和细胞周期调节剂来提升蛋白表达水平；
②融合蛋白标签：低产量提高蛋白表达的策略可使用分子融合伴侣技术。该策略利用启动子、增强子、标签和其它融合元件来提高蛋白的溶解度。蛋白标签是插入到重组蛋白上的短肽序列，通常会在蛋白表达结束时采用酶切或化学试剂去除，比如His,Flag,GST；Fc等。
③温度：对于HEK293和其它哺乳动物细胞系，在37°C、5% CO2孵箱中培养细胞。有研究表明，在转染后24小时将温度从37°C降至33°C培养，可提高HEK293细胞的蛋白表达。
如何选择蛋白表达系统
目前，较为主流的表达宿主有大肠杆菌（E.coli）、毕赤酵母（P.pastoris）、昆虫-杆状病毒（Bac-to-Bac系统）以及哺乳动物细胞系（CHO、HEK293）等。
蛋白表达系统 | 优点 | 缺点 |
细菌 | 1. 遗传背景清楚；2. 繁殖快、成本低、抗污染能力强；3. 表达量高、表达产物分离纯化相对简单、稳定性好；4. 商品化的载体和菌株种类非常齐全、适用范围广等。 | 1. 没有真核转录后加工的功能，没有翻译后修饰；2. 表达的蛋白质经常是不溶的，容易形成包涵体；3. 有一些真核蛋白的产量和活性较低；4. 难以表达大分子哺乳动物蛋白质；5. 可能会产生一些致热源(内毒素) |
酵母 | 1. 结合了真核和原核的优点，可生产翻译后修饰的分泌蛋白和胞内蛋白；2. 经济高效，部分真核翻译后修饰，如糖基化，磷酸基化。 | 1. 可能形成不正确的蛋白糖基化；2. 培养上清多糖浓度高不利于纯化 |
昆虫 | 1. 表达水平高（特别是细胞内蛋白），较快的生长速度，有效的细胞折叠，中度可扩展性；2. 广泛的翻译后修饰，糖基化与哺乳动物细胞类似，相对容易地酶促的去糖基化（对于蛋白结构测定有利），3. 无内毒素。4. 易于操作。杆状病毒基因组较小，分子生物学特性简单；5. 昆虫细胞悬浮生长，容易放大培养；6. 可表达较大的外源性基因而不影响本身增殖； | 培养基昂贵（现已培养基成本有所下降，各种无血清培养基广泛被应用），需要大量的病毒，亲肽的分泌通路低效，糖基化仍然不同于哺乳动物细胞，病毒侵染会导致细胞裂解和潜在的表达蛋白降解。 |
哺乳动物稳定表达系统 | 1. 蛋白活性：翻译后再加工修饰折叠的功能产生的外源蛋白质，更接近于蛋白质的天然状态。2.正确的高级结构（如糖基化）。3.在蛋白的起始信号、加工、分泌、糖基化方面具有独特优势，适合表达完整的大分子蛋白。 | 培养基成本高，培养周期长，至少一个月以上，培养较困难，表达量较低。构成复杂、操作技术要求高、表达产量不大、产率低 |
哺乳动物瞬时表达系统 | 1. 适度快速表达2. 很好表达膜蛋白和分泌蛋白3. 所有蛋白都能进行折叠和最真实的翻译后修饰 | 1. 比较贵2. 胞内蛋白产量低 |
总之，各种表达系统各有优缺点，使用大肠杆菌表达系统成本相对较低，并且能够在较短时间内获得表达产物，但目的蛋白常以包涵体形式表达，产物纯化困难，且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善，表达产物的生物活性较低。酵母和昆虫细胞表达系统蛋白表达水平高，成本低，但翻译后加工修饰体系与哺乳动物不完全相同。哺乳动物表达系统产生的蛋白质更接近于天然状态，但表达量低，操作繁琐。因此，选择表达系统时，应充分考虑各种因素，如要表达蛋白的性质、生产成本、表达水平、安全性、表达周期等。
本文来源于功能基因研究策略
转自：“Super Lab”微信公众号
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