大家在 qPCR 实验过程中，是否会经常遇到异常扩增曲线和熔解曲线的困扰，比如断裂的扩增曲线、复孔间重复性不好、熔解曲线杂峰.....甚至还有其他千奇百怪问题，令人头大～
01 什么是扩增曲线和熔解曲线
对于荧光定量 PCR 结果的判断，最直观就是看扩增曲线是否「漂亮」，即扩增曲线是否符合正常标准。如果是做染料法 qPCR，还需要检查熔解曲线是否符合标准。
扩增曲线是随着 PCR 反应的进行，扩增产物不断积累，荧光信号强度不断增加，仪器每经过一次循环，收集一次荧光信号，通过荧光强度的变化监测扩增产物量的变化，得到的扩增曲线图[1]。
扩增曲线线性图谱
熔解曲线是指反应随温度升高，双链扩增产物逐渐解链，荧光信号逐渐减小的曲线。
原始的熔解曲线荧光图谱为左图，将荧光值求负导数之后得到右图的熔解曲线图，熔解曲线的特征峰对应的横坐标为 DNA 双链分子解链一半时的温度，即 Tm 值。不同 DNA 分子由于长度和 GC 含量的不同，Tm 值有所不同，因此可以根据熔解曲线是否单峰、以及 Tm 值大小来判断非特异性扩增以及引物二聚体。
良好的扩增曲线和熔解曲线的标准主要有：
1）扩增曲线有明显的 4 个时期，基线期平滑无上扬，拐点清楚，指数期明显，曲线整体平滑。
2）复孔间扩增曲线的指数增长期重复性较好。
3）熔解曲线单峰。
02 问题曲线分析
往往是正常的曲线千篇一律，问题曲线千奇百怪，导致这些问题曲线的原因也各不相同。今天，我们就来了解下问题曲线背后的原因，快来看下你有没有遇到过同样的问题吧～
扩增曲线相关问题
➣ （1）无扩增曲线
可能的原因：
1. 没有打开荧光信号采集。检查程序设置，三步法扩增程序在 72℃ 延伸阶段采集信号，两步法扩增程序的信号采集设置在退火延伸步骤。
2. 引物降解。可通过 PAGE 电泳检验引物的完整性。
3. 模板浓度低。建议增加模板投入量或重新制备较高浓度模板。
➣ （2）扩增曲线不光滑
可能的原因：
1. 仪器长时间未校准，在检测中出现了波动，建议定期校准仪器；
2. RNA 模板不纯，建议增大模板稀释倍数或者重新制备较高纯度的 RNA 模板。
➣ （3）扩增曲线平台期抖动
可能的原因：仪器与管材不匹配导致的信号采集产生波动。
➣ （4）扩增曲线右下方下落呈倒扣状
调整前
调整后
可能的原因：模板浓度过高，基线终点值大于 CT 值，仪器默认起峰位置仍为基线期，将起峰位置往基线下拉，所以扩增曲线变成了倒扣的 S 形（左图）。可适当减小基线范围，手动调整基线终点值至 CT 值 -4，调整基线范围后，扩增曲线即恢复正常（右图）。
➣ （5）扩增曲线呈锯齿状断裂
调整前
调整后
可能的原因：试剂中的参比荧光染料 ROX 浓度与仪器机型不匹配导致的 Badrox，往往出现在需要高浓度 ROX 校正的 ABI 7900HT、StepOne 等仪器上。可在「Setup」中进行设置，将「Passive Reference」的「ROX」调整为「None」，扩增曲线即恢复正常。曲线恢复正常后，该数据能够采用需根据复孔重复性进一步判断。
➣ （6）扩增曲线基线期上飘
调整前
调整后
可能的原因：仪器默认基线期范围较小，可手动将基线范围调大，扩增曲线即恢复正常。
熔解曲线相关问题
➣ （1）有扩增曲线无溶解曲线
可能的原因：可在「Run Method」或「Run Editor」中检查是否有设置熔解曲线步骤或熔解曲线信号采集是否打开。
➣ （2）熔解曲线杂峰
a. 杂峰在主峰之前
可能的原因：杂峰在主峰之前，Tm 在 70～75℃ 范围内，一般是引物二聚体。引物二聚体是引物 3’ 端的部分碱基互补结合，在 Taq 酶的作用下，3’ 端延伸后得到的小分子量的双链 DNA 片段。可根据 NTC（无模板阴性对照）判断是否为引物二聚体。
解决方案：建议通过提高模板浓度、提高退火温度、降低引物浓度来改善。
b. 杂峰在主峰之后
可能的原因：非特异性扩增，可能由于引物特异性较差，或体系中有气溶胶污染（可结合 NTC 确定体系是否有污染）。建议先提高退火温度，可提高扩增特异性。如果提高退火温度对于特异性没有改善，建议更换特异性较高的引物。
➣ （3）熔解曲线十字型
调整前
调整后
可能的原因：试剂中的 ROX 浓度与仪器机型不匹配导致的 Badrox，往往出现在需要高浓度 ROX 校正的 ABI 7900HT、StepOne 等仪器上。可在 Setup 中进行设置，将 Passive Reference 的 ROX 调整为 None，熔解曲线即恢复正常。曲线恢复正常后，该数据能够采用需根据复孔重复性进一步判断。
转自：“Super Lab”微信公众号
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