如何制备化学感受态细胞？

2024/2/1 16:09:41　阅读：69　发布者：

几乎所有分子生物学实验室的科研小白都需要学习设计、修饰或者构建质粒，今天我们就来介绍一下如何制备化学感受态细胞吧。

Plasmid

一、什么是化学感受态细胞？

在说化学感受态细胞之前，我们要先清楚一个概念：感受态。细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态（competence）。自然环境中细菌可以吸收外源遗传物质以增加自身对环境的适应性。人工感受态的形成，需要低温和钙处理，这样可能破坏了细胞膜上的脂质阵列，Ca2 +与膜上的多聚羟基丁酸化合物、多聚无机磷酸形成复合物利于外源DNA 的渗入，外部理化因素促进了感受态的形成。

在清楚了这个概念之后，我们一起来看看感受态细胞吧。一般常用的感受态细胞分为化学感受态细胞和电转化感受态细胞两种，平时我们构建质粒时使用化学转化感受态细胞即可。受体细胞经过一些特殊方法（如：CaCl2，RuCl等化学试剂法）的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。

那么化学感受态细胞就是一种经氯化钙处理，促进质粒 DNA 黏附于感受态细胞膜上的细胞。将感受态细胞通过水浴热激，使细胞膜孔打开，从而质粒可以进入。

例如野生型大肠杆菌并不容易转化，这是由于DNA无法进入野生型大肠杆菌的细胞。经过多年的努力，科学家们发现了一种方法可以增加细胞吸收外源DNA的效率。那就是用化学方法处理细胞，使其改变膜对DNA的通透性。这种细胞就称为感受态细胞，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。这种方法已经成为基因工程的常规技术，它对于我们利用体外DNA重组技术来了解真核和原核生物的基因功能特别重要。

细菌的感受态有两种类型：一种是自然感受态（Natural competence），自然感受态细菌可以自由地吸收DNA，通过它来进行遗传转化；另一种是人工感受态（Artificial competence），在这种转化中，细菌发生改变使得它们能摄入外源DNA。枯草芽孢杆菌属于能够发展为自然感受态的细胞，大肠杆菌就属于需要人工处理的细胞。

二、感受态细胞的种类

根据不同实验目的，感受态细胞来源有原核受体细胞（大肠杆菌G-、乳酸菌G+、枯草杆菌G+等）和真核受体细胞（酵母菌、动植物、昆虫等）。大肠杆菌作为构建普通质粒、病毒载体和各种文库以及异源蛋白表达的重要工具，其相应的感受态在分子克隆实验与蛋白表达实验中是极其重要的。

目前市面上的大肠杆菌细胞种类相当多，其都是为了特定的目的而构建的，比如：高速生长/分裂，高通量克隆，普通克隆等。那不同的感受态之间的区别是什么呢？答案是基因型（即感受态的身份证），不同基因型的大肠杆菌可以满足不同的实验目的。下面来给介绍一下感受态的种类。

1、提高外源质粒的完整性和稳定性

2、代谢相关基因型

3、提高转化效率

4、不同的蛋白表达机制

那么除了上述比较详细的分类，下面几种就是我们在实验室中最最常用的几种了。

特别是DH5α细胞，一种常用于质粒克隆的菌株。其φ80，lacZΔM15基因的产物可与pUC载体编码的 β-半乳糖苷酶氨基端实现α互补，可用于蓝白斑筛选。recA1和endA1的突变有利于克隆DNA的稳定和高纯度质粒DNA的提取，小编的日常实验也是使用这个菌株呢。

细菌转化是基于细菌释放DNA的自然能力，然后被另一个有能力的细菌吸收。转化的成功与否取决于宿主细胞的能力。能力是指细胞在转化过程中吸收裸DNA的能力，自然可转化的生物体在固定期后期通过自溶自发释放DNA。一些细菌，包括大肠杆菌可以在实验室中人工处理，通过化学物质，如钙，或施加强电场(电穿孔)或使用热冲击来增加它们的可转化性。电穿孔或热休克通过增加细胞壁的渗透性来增加能力，这允许供体DNA的进入。类似地，如果转化的DNA含有可选择的标记，如抗微生物药物耐药性，或者如果DNA编码利用生长因子，如氨基酸，则可以选择转化子。

在大多数自然活性的细菌中，游离的DNA与细菌结合，并整合到染色体DNA中。有时，游离的DNA被插入到能够从染色体自主复制的质粒中，因此，插入的DNA不必与染色体整合在一起。质粒编码一些酶和耐抗生素标记，转化后在转化体中表达。在这个转化过程中，供体DNA首先被插入质粒中。然后将含有供体DNA的质粒插入活性宿主细菌中。转化完成后，含有质粒的细菌可以通过使用添加了特定抗生素的生长培养基来检测。