酵母双杂交原理和载体的选择

酵母双杂交系统(yeast two-hybrid)以酵母遗传分析为基础，研究反式作用因子之间相互作用对真核基因转录调控影响的实验系统。其最有价值的应用是用BD-X筛选由AD-Y构成的cDNA文库，以获得新的蛋白质之间的相互作用，并分析研究新的基因。 酵母双杂交不仅可用于鉴定新的蛋白质相互作用，证实可疑的相互作用，确定相互作用的结构域，而且可直接获得编码相互作用的蛋白的基因。

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酵母双杂交实验原理

酵母双杂交（yeast two-hybrid）技术的的基本原理是：许多转录因子都包含两个相互独立的功能结构域，即DNA结合结构域（binding domain，BD）和转录活化结构域（activedomain，AD）。转录因子通过BD和AD分别与DNA上的特异序列结合，从而启动相应基因的转录。

酵母双杂交系统首先构建两种反式作用因子，将蛋白质X与报告基因转录因子特异的BD（如Gal4-BD，LexA-BD）融合，成为钓饵（bait）；蛋白质Y与特异的AD（Gal4-AD，B42-AD）融合为猎物（prey）。当编码两种结构域的基因在酵母细胞核内同时表达时，若蛋白X与Y之间存在非共价作用，就会使AD与BD两结构域的上游活化序列（upstream ac-tivation sequence，UAS）相互接近，进而激活转录过程，使报告基因（如HIS3、LEU和lacZ等）得到表达。

BD与AD之间的连接（相互作用）能够有效地活化转录。由非共价键连接的两个结构域也可以通过蛋白之间的相互作用将BD和AD连接起来，从而启动转录；反之，也可以通过报告基因表达来评价结构域连接蛋白之间是否存在相互作用。

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酵母双杂交常用载体

重组Activation Domain（AD）融合的重组质粒（pGADT7载体）以及Binding Domain（BD）融合的重组质粒（pGBKT7载体）

pGADT7载体

pGBKT7载体

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酵母双杂交技术的应用

检验一对已知蛋白(或结构域)间的相互作用;

用已知功能的蛋白基因筛选 cDNA 文库，寻找互作蛋白，根据钓到的基因功能推测该新基因作用网络。

酵母双杂交系统主要应用于快速验证已知蛋白之间的相互作用或寻找新的相互作用蛋白质，尤其在寻找蛋白质互作区域时相当有优势。其优点有：

(1)采用高拷贝和强启动子的表达载体使目的蛋白过量表达，方便复合物形成;

(2)筛选过程在真核酵母活细胞内进行，一定程度上反映了体内的真实情况;

(3)检测的结果是基因表达产物的级联效应，通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱的或暂时的相互作用，而细胞内的免疫共沉淀依赖于两个互作蛋白质的解离程度，因为在免疫沉淀的过程中通过洗涤的过程降低了互作信号;

(4)文库来源广泛，可采用不同组织、器官、细胞类型和特殊分化时期材料构建成cDNA文库。

缺点有：目前的酵母双杂交方法存在操作复杂，假阳性和假阴性多，结果主要为定性数据，不易精确判断蛋白质相互作用的强度等问题。酵母双杂交结果需要再用其他方法进行进一步确认。

转自：“Super Lab”微信公众号

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