大肠杆菌化学转化原理和问题解决

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DNA要进入细胞需要克服的困难

困难1：DNA带负电荷，细菌的细胞膜也带负电荷，需要克服DNA和细胞膜间的电荷排斥作用；

困难2：DNA进入细胞需要细胞膜上有孔隙。

图1.DNA和细菌细胞膜的电荷排斥

克服电荷排斥

化学感受态细胞转化的第一步，加入DNA后，轻弹管壁混匀，冰上静置，使Ca2+与DNA结合中和DNA的负电荷，Ca2+与细菌细胞膜结合中和电荷，克服了外来DNA和细菌细胞膜之间的负电荷排斥作用。Ca2+与DNA和细菌细胞膜脂多糖的磷酸盐形成配位络合物，Ca2+促进了DNA和脂多糖的结合。

图2.Ca2+克服了外来DNA和细菌细胞膜之间的负电荷排斥

孔隙的形成与消失

化学感受态细胞转化的第二步是热激。热激使温度升高，细胞膜的脂质释放（图3-A），在细胞膜上形成孔隙（图4-E），DNA进入细菌内部。热激后在冰上冷却2min，温度降低，细胞膜的蛋白质释放（图3-B），脂质占比增高，细胞膜的流动性升高，细胞膜上的孔隙消失（图4-F）。

图3.A：脂质释放曲线，B：蛋白质释放曲线

从图4的电镜图我们明显可以看到热激之后可以看到大肠杆菌的形成的空隙，这个空隙是外源DNA进入大肠杆菌的入口。

图4.感受态细胞在转化过程中表面形态的变化

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抗性基因的表达

化学感受态细胞转化的第三步，加入LB培养基，37℃复苏，该步骤的主要作用是使感受态细胞恢复生长，使感受态细胞中的质粒表达抗性基因，这样在涂板后带有目标质粒的大肠杆菌在相应抗性的平板上才能正常生长。

综上，化学感受态细胞在转化过程中进行冰上放置是为了使DNA吸附到感受态细胞表面；热激步骤使感受态细胞表面形成孔洞，DNA进入感受态细胞内；冰上孵育使感受态细胞的孔洞消失；37℃复苏是为了是细胞恢复生长并表达抗性基因。

1，为什么一开始要冰上，室温为什么不可以？

2，为什么是42度，而不是其他温度，如37度，100度？

3，外源DNA如何进入了大肠杆菌？

第一个问题：因为要低温。实验室最容易获得的低温就是冰上0度低温。

首先比较好理解的是低温可以减少分子运动，这样有助于稳定DNA与细胞膜的吸附作用。

其次是低温可以稳定细胞膜上lipopolysaccharides（LPS)脂多糖系统上的“洞”，有利于DNA分子与其吸附，从而促进细胞吸收DNA分子。

然后低温0度与热激42度之间的温差可以改变细胞膜的流通性，促进已吸附的DNA分子进入细胞。

最后低温0度条件下也可以保护DNA免受DNA酶的分解。

第二个问题：答案是都可以，也可以在37度热激，但是不能超过大肠杆菌致死温度。因为42度热激条件下转化效率最高，前人做过不同温度，不同时间热激的实验，发现了这个温度效果是做好的。低温以后突然高温处理一下可以让大肠细胞内外的presure有差异，更容易让外源DNA进入大肠细胞内，42度以下的温度理论上都是可以转化的，但是效率就不够，也就是不足让你筛到阳性克隆。

第三个问题，DNA到底是如何进入的？

回答前面的两个问题其实已经部分解释DNA是如何进入大肠杆菌细胞的。还有一个细微的机制是大肠杆菌感受态最后都是悬浮在氯化钙溶液中的。为什么是氯化钙呢？

最主要的是钙离子的作用，带正电荷的钙离子就像粘合剂将带负电荷的DNA和负电荷的脂多糖（LPS)粘合在一起。热激形成洞之后加上细胞膜的流行性，有概率DNA就进入了大肠细胞内了。那么其他离子可以吗？类似有这样作用的离子都是可以的，比如镁离子，但还是氯化钙最便宜。

转自：“Super Lab”微信公众号

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