单倍体剂量不足（HI）基因的缺失（deletion）或三倍体剂量敏感（TS）基因的重复（duplication）会导致浓度依赖性的表型效应，而这些剂量敏感现象的具体机制仍然有待研究 [1]。相分离现象同样以浓度依赖的方式驱动生物大分子形成多种功能的凝聚体 [2，3]，这表明剂量敏感和相分离过程之间存在潜在联系，有待进一步系统研究。
近日，北京大学基础医学院医学生物信息学系李婷婷研究组与清华大学生命科学学院吝易研究组在 Genome Biology 杂志上在线发表文章 Phase separation as a possible mechanism for dosage sensitivity，提供了剂量敏感现象与相分离过程之间关系的系统分析，提出了基于异常相分离的剂量敏感潜在分子机制模型。
该研究利用生物信息学分析和实验证明了相分离和剂量敏感之间具有密切联系。作者利用生物信息学方法发现剂量敏感基因的产物表现出更高相分离倾向，基因剂量敏感评分与基因产物的相分离预测分数呈现出高度相关性（图1）。作者进一步通过实验验证了3个已知剂量敏感蛋白（HNRNPK、PAX6和PQBP1）在体外和细胞内相分离能力和剂量关系。
图1 A. 具有高剂量敏感性的基因集相分离分数比较。B. 剂量敏感分数和相分离分数的核密度回归图。
在发现剂量敏感和相分离存在高度相关的现象后，作者接下来探讨了剂量敏感基因上的致病变异是否会影响相分离过程。通过数据库分析和实验验证，作者发现剂量敏感基因的致病变异可以通过降低蛋白质浓度水平或缺失相分离易发生区域来扰乱相分离过程（图2A）。对于降低蛋白质浓度水平类型的致病变异，作者通过CRISPR-Cas9构建了杂合敲低细胞系，发现SOX2或PAX6蛋白在野生型细胞的细胞核中形成了大量的斑点，而杂合敲低细胞系中的斑点显著减少（图2B-C）。针对易发生相分离区域缺失类型的致病变异，作者构建了长度各异的PQBP1截短突变体，发现相分离倾向区域的截断确实能减弱PQBP1蛋白相分离能力，且证明该区域截断越长，蛋白相分离能力越低，包含易相分离区域的长度与蛋白相分离能力成正相关（图2D-E）。
图2 A. 基于ClinVar数据库对单倍体剂量不足基因上疾病相关突变的筛选过程。B-C. 野生型（WT）细胞和杂合缺失SOX2或PAX6的敲低（KD）细胞中内源性SOX2或PAX6的共聚焦图像。D. PQBP1突变蛋白的相分离相图。E. 野生型PQBP1蛋白、截断体PQBP1蛋白和mCherry瞬转转染的活PQBP1敲除细胞的共聚焦图像。
剂量敏感基因上的致病突变会导致异常相分离过程，为了评估相分离过程异常对细胞的影响，作者首先分析了单细胞干扰转录组学数据。发现相分离基因与剂量敏感基因扰动产生相似的功能障碍表型（图3A），实验进一步验证回补此类蛋白（如FUS）能够恢复下游基因的表达。鉴于剂量敏感和相分离之间存在紧密联系，而现有相分离预测器性能仍有不足，作者利用机器学习整合剂量敏感相关指标，建立了一个新型相分离预测器DosPS，基于群体遗传学数据对剂量敏感基因产物相分离性能进行预测。该预测器性能比现有基于序列的预测器更加优越（图3B），更重要的是，DosPS可以避免传统基于序列的相分离预测器对蛋白无序区域的偏倚，因此提升了相分离蛋白预测性能。
图3 A. 单细胞干扰转录组学数据能量测试p值的累积分布函数图。B. 测试集上预测相分离蛋白的AUC性能。
剂量敏感性常用化学计量不平衡性进行解释 [1]，而本研究提供了一种新的分子理论：基于相分离解释剂量敏感性（图4）。正常生理条件下，纯合野生型基因的蛋白表达量足以触发相分离过程。对于单倍体剂量不足的基因，引发蛋白浓度水平降低或相分离易发生区域缺失的突变都会导致相分离异常，进而引发疾病。对于三倍体剂量敏感基因，基因拷贝数的异常增加导致蛋白质的过量产生，会导致该蛋白的异常聚集，下游途径过度激活，进而引发疾病发生。
图4 相分离解释剂量敏感性模型的示意图。
研究简介：
本研究认为异常相分离是与剂量敏感基因功能障碍相关的生物过程。作者将疾病与相分离蛋白浓度异常的关系紧密联系在一起，期望未来能够通过异常相分离过程的矫正来治疗剂量敏感相关疾病。
北京大学基础医学院硕士生杨亮、清华大学生命科学学院博士生吕佳励、李蹊以及北京大学基础医学院博士后郭改改为本论文共同第一作者，李婷婷研究员和吝易研究员为本文共同通讯作者。北京大学医学信息学系李婷婷课题组（http://bioinfolilab.phasep.pro/）专注于生物大分子凝聚体组成及动态调控的计算解析、蛋白质翻译后修饰调控网络和多组学数据综合性挖掘的生物信息学研究工作，用信息和系统的观点和方法研究生命科学基础问题，探索生命系统机理。
参考文献：
1.Collins RL, Glessner JT, Porcu E, Lepamets M,Brandon R, Lauricella C, Han L, Morley T, Niestroj LM, Ulirsch J, et al: A cross-disorder dosage sensitivity map of the human genome. Cell 2022, 185:3041-3055 e3025.
2.Banani SF, Lee HO, Hyman AA, Rosen MK: Biomolecular condensates: organizers of cellular biochemistry. Nat Rev Mol Cell Biol 2017, 18:285-298.
3.Tsang B, Pritisanac I, Scherer SW, Moses AM, Forman-Kay JD: Phase Separation as a Missing Mechanism for Interpretation of Disease Mutations. Cell 2020, 183:1742-1756.
转自：“BMC科研永不止步”微信公众号
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