以下文章来源于林木科学评论 ，作者Wanglab
2024年1月，瑞典农业科学大学（SLU）植物生物学系、林奈植物生物学中心Charles Melnyk课题组于Nature Plants 在线发表了题为"A conserved graft formation process in Norway spruce and Arabidopsis identifies the PAT gene family as central regulators of wound healing"的研究论文。该研究开发了一种针叶树有效嫁接近缘种和远缘属的微嫁接方法，揭示了光敏色素A信号转导因子1 (PAT1)是嫁接植物愈合的核心调节因子，研究结果为远缘物种嫁接提供了新的见解和参考。
背景
01
嫁接最初是一种无性繁殖的手段，但现在通常用于提高植物抗逆性，保持品种特征和提高产量上。裸子植物的进化大约比被子植物早2亿年，在森林环境中占主导地位，具有重要的经济和生态价值。目前，裸子植物被广泛嫁接以繁殖出适合林业育种计划和园艺栽培的理想品种。前人的研究揭示了嫁接植物动态愈合的过程以及影响嫁接组织形成的差异基因表达，并开发了一种利用胚胎组织进行远亲嫁接的方法。基于此，本研究开发了一种高效实用的嫁接方法，即利用幼嫩的针叶树促进嫁接接点快速愈合，使几个种间和属间的嫁接组合成功形成。同时，该研究在挪威云杉(Picea abies)和拟南芥中发现了一种保守的嫁接植物组织形成途径，该途径涉及细胞分裂、血管分化以及细胞壁和生长素相关基因的上调。此外，本研究还发现PAT1基因上调在拟南芥和云杉嫁接中很常见，并且该基因在裸子植物之间伤口的愈合中似乎具有保守作用。
结果
02
一种针叶树嫁接的新方法
为了提高嫁接的成功率和简便性，研究人员开发了一种利用10-12天龄云杉(Picea)和松树(Pinus)幼苗微嫁接方法。即在下胚轴区域切除植株，使用硅项圈将不同植株的接穗和砧木紧密连接在一起(图1a,b)，该嫁接方法极大提高了嫁接效率。
研究人员利用同种植物相互嫁接的检验方法，用羧基荧光素(CFDA)处理接穗和砧木，嫁接10天后，观察到近一半的植株将CFDA从接穗转运到砧木，这与植物体内组织之间转运情况一致。在20-25天时，几乎所有嫁接个体的运输动态都与没有嫁接植物韧皮部和木质部的连通性一致(图1c,d)。研究人员又用碱性品红染色嫁接接点的手切片以验证木质部相关木质素的存在。嫁接成功后，木质部在接口处连接，而未连接的植株几乎没有木质部染色(图1e)。嫁接2个月后，嫁接的云杉和松木成活率为90-100%(图1b)。证明该方法是一种高效、实用的针叶树幼树嫁接方法，可使嫁接接点在嫁接后迅速形成木质部和韧皮部连接。
微嫁接实现了异种嫁接
先前的研究发现，随着针叶树种间亲缘关系越来越远，嫁接成功率降低，不亲和性增加，属间嫁接通常无法实现。因此研究人员想要测试微移植方法是否能克服这一障碍。首先对亲缘关系最近的云杉和松属间的嫁接进行测试(图2a)。发现不同的基因型短期内同种嫁接或异种嫁接的存活率很高，但由于木本植物不相容性可能在嫁接数年后出现，因此研究人员将植物移栽到土壤中进行长期观察，发现同种嫁接植株在嫁接2.5年后的存活率仍然很高(90%-100%)，但异种嫁接的云杉-松组合存活率较低(表1)。
研究人员发现，将云杉不同部位分别与欧洲松、曲松嫁接，云杉砧木要比云杉接穗和松对应组织组合嫁接存活率高得多，并且嫁接成功的异种嫁接植株与完整植株的高度相似，云杉砧木似乎还缩短了松接穗的针尖长度(图2c-f)。这些结果表明，微嫁接可以成功地形成几个种间和属间的嫁接，并且云杉砧木可以通过不同的接穗实现长期嫁接。
嫁接激活维管和细胞分裂相关基因
为了了解针叶树嫁接背后的过程并鉴定差异表达的基因，研究人员从0、1、3、7、14和28天于嫁接成功以及未嫁接的云杉嫁接点上方和下方取样进行RNA测序(图3a)。主成分分析(PCA)显示，样本主要按组织类型和时间点聚类，接穗和砧木样本之间密切相关(图3b)。为了分析嫁接植物组织中常见的基因表达模式，研究人员使用Mfuzz分析将差异表达基因(DEGs)分组为12个簇(图3c-e)。根据之前研究，研究人员将与嫁接有关的重要基因找出并观察其分布在哪些cluster中。发现Cluster5包含在砧木和接穗形成中稍晚增加的基因，包括细胞周期相关基因，如PaCDKB2、2-like。Cluster6包含接穗和砧木中的早期激活基因，如与损伤相关的PaWOX13-like基因。而韧皮部相关的PaAPL-like基因、木质部相关的PaPRX66-like基因和PaVND4-like基因具有中后期激活的趋势(图3c-e)。
为了比较嫁接针叶树和双子叶植物的基因表达谱，研究人员分析了来自拟南芥的嫁接转录组学数据集，发现上述几个云杉基因同源物的表达在拟南芥中具有相似的表达模式(图3f-h)。因此，在拟南芥和云杉嫁接过程中同源基因的激活几乎是一致的，表明这是一个保守的嫁接过程，其首先是伤口反应，随后是细胞分裂，最后是韧皮部和木质部分化。
生长素反应增强
并与细胞壁相关基因表达相关
生长素和细胞分裂素在维管形成过程中发挥了重要作用，为了探讨这两种激素是否与云杉嫁接形成有关。研究人员用合成细胞分裂素(BAP)、生长素(IAA)和两者一起（BAP+IAA）分别处理2周大的幼苗，于处理0天、5天、10天和15天(图4a)收集云杉下胚轴组织用于RNA-seq分析。从单个时间点来看，数千个基因对生长素或两种激素都有反应，而对细胞分裂素有反应的基因较少(图4b-d)。分析BAP或IAA与BAP+IAA作用的表达基因的重叠情况，提取在三个时间点由细胞分裂素或生长素单独诱导的激素响应基因(图4c,d)。对生长素响应基因在嫁接的接穗和砧木转录组中比较，发现从3天开始，接穗和砧木中生长素诱导基因富集上调，而接穗和砧木中生长素抑制基因的富集下调(图4e)。由细胞分裂素单独诱导的上调基因在接穗或砧木中几乎没有富集，但细胞分裂素诱导的抑制基因在较晚的时间点富集，尤其是在砧木中(图4f)。此外，细胞壁形成相关基因在外源生长素处理和嫁接后均表现出差异表达，特别是受生长素处理和嫁接影响的漆酶和果胶甲酯酶（PME）之间存在大量重叠(图4h)。这些结果表明，嫁接过程在接点处诱导了生长素反应，并与嫁接植物接点处细胞壁相关基因的激活有关。
保守的PAT1基因家族促进嫁接植物愈合
为了进一步探索云杉嫁接形成的转录调控，研究人员通过WGCNA加权相关网络分析，挑选了在接穗和砧木中特异性表达差异，而在完整植株中表达无差异的模块生成基因调控网络(图5a,b)。该模块中PaPAT1-like、PaWIP4-like、PaMYB4-like、PaLRP1-like和PaMYB123-like这5个转录因子高度上调，充当了调控网络的枢纽(图5a-c)。
然后，研究人员发现拟南芥同源基因LRP1、MYB4和PAT1也在拟南芥嫁接过程中被诱导表达，这表明拟南芥和云杉之间存在广泛保守的调控反应(图5c)。由于PAT1基因家族能促进根尖再生，研究人员重点关注这个家族，并构建了拟南芥愈伤组织PAT1过表达系(AtPAT1OE)和PAT1突变体。实验发现，AtPAT1OE在叶柄损伤部位愈伤组织形成增加，而pat1、pat1scl5和pat1scl5scl21系愈伤组织形成明显受损。与野生型(Col-0)相比，scl5在愈伤组织形成方面表现出轻微缺陷，而scl21没有表现出重大差异(图5d-f)。
为了研究PaPAT1-like是否具有与拟南芥PAT1相似的功能，研究人员克隆了云杉PaPAT1-like基因，在拟南芥中建立了诱导过表达系(PaPAT1-likeOE)。结果发现，与野生型相比，PaPAT1-likeOE增加了切割叶柄的愈伤组织面积(图5g)。为了研究PAT1在嫁接中的作用，对拟南芥嫁接植物的附着率进行统计分析，发现pat1scl5、scl5scl21、pat1scl21和pat1scl5scl21的附着率都降低了(图5h)。在CFDA介导的韧皮部重连实验中，PAT1突变体都表现出中度到强烈的韧皮部重连抑制(图5i)。研究人员还发现PaPAT1-likeOE可以部分修复pat1scl5和scl5scl21双突变体的嫁接植物附着缺陷(图5j)。以上结果表明，嫁接诱导的PAT1上调在拟南芥和云杉之间是共享的，并且该基因在幼年组织的伤口愈合中具有保守作用。
讨论
03
嫁接是进行物种繁殖和组合的普遍方式，胚胎组织的使用使得单子叶的嫁接成功实现。在本研究中，研究人员开发了一种微嫁接方法，利用幼嫩组织使得分化较远的针叶树嫁接成功。并发现不同植物嫁接中生理和基因表达的变化存在多重相似性，表明嫁接组织形成是一个保守的过程，并且嫁接接头处生长素响应的升高与细胞壁相关基因的激活相关。
本研究确定了PAT1是植物组织附着和嫁接植物形成的一种新的调节因子，且PAT1可能是幼体组织具有更高再生能力的关键因素。研究结果显示，嫁接幼体组织有助于克服裸子植物和被子植物的不亲和性，并为扩大种子植物成功嫁接范围提供了一个有用的工具。
来源：林木科学评论
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