背景介绍:
自从2013年荣获诺贝尔奖后，外泌体一直是国际科研界的研究热点。近十年来，该话题持续受到广泛关注，并且目前稳居国内自然科学热点排行榜的第五名！让我们继续探索这一细胞外囊泡的神秘之处。
外泌体个人名片:
名称：外泌体（Exosome）;
种属: 细胞外囊泡;
粒子大小范围为直径30-150nm。
密度为1.1-1.18g/mL;
物体呈现出“茶托状”的形状。
来源：所有活细胞所分泌;
存在于几乎所有的组织、细胞间隙和体液中。
人体内约有1014个细胞，每个细胞平均产生1000-10000个细胞。
本物质具有多种功能，包括调节细胞代谢、控制炎症、促进血管新生、促进组织修复、免疫调节以及抗癌作用等。
荣誉：2013年获得诺贝尔生理学或医学奖。
携带物质包括脂质、蛋白质、DNA和RNA（miRNA、lncRNA、circular RNA、mRNA）；
突出特性：异质性，即同一种细胞分泌的外泌体可能具有不同的功能;
图 外泌体结构与特征
外泌体的特性及其相关应用:
异质性可以作为生物标记物，用于疾病诊断。
外泌体的数量、细胞膜与内容物成分以及生物学功能显示出了异质性。此外，外泌体的大小和含量能够反映分泌细胞的类型和状态，并且精确调控机体内的多种生理活动。因此，外泌体作为生物标志物可用于疾病诊断。通过分离和提纯体液中的外泌体，并分析其内含的特征miRNA或蛋白质等，可以与疾病特征标志物进行比对，从而判断疾病类型。
具有呈递性，可应用于免疫调控
外泌体通常通过传递多种生物分子来完成抗原呈递、免疫活化抑制以及免疫耐受的过程。其中，抗原呈递细胞分泌的外泌体能够携带并呈递相关复合物，以达到通过减弱或增强免疫反应来实现免疫治疗的目的。此外，外泌体还携带着许多与免疫相关的分子，其中包括溶酶体相关膜蛋白1和2、免疫球蛋白超家族成员8以及主要组织相容性复合体(MHC)，这些分子能够与特定的肽链特异性结合并引发免疫应答。
3、具有脱免性，可以用作药物递送载体
外泌体具有较低的免疫原性特点，使其能够逃避大部分免疫系统的识别和攻击。与传统化学药物相比，外泌体具有许多优势，例如纳米尺度的体积，低细胞毒性，良好的生物膜透过性和生物相容性。此外，外泌体的脂质双层膜结构有助于保护其所载药物免受降解，以维持其生物活性。因此，外泌体可作为药物的载体，帮助药物逃避免疫系统的清除，跨越组织屏障，提高药物的递送和吸收效率。
4、具有促瘤作用，可以用于治疗肿瘤
肿瘤细胞通过外泌体来促进肿瘤发展。外泌体可以调节机体的免疫功能，但同时也向受体细胞传递有害信息，导致细胞病变。此外，肿瘤细胞还通过分泌外泌体将一部分药物排出细胞或与功能性药物抗体结合，从而降低药效并产生耐药性。众多研究表明，晚期肿瘤细胞释放的外泌体可以抑制抗肿瘤免疫反应，从而促进肿瘤的增长和蔓延。近年来，外泌体在肿瘤治疗应用方面带来了许多新的干预措施，例如抑制外泌体的生成、分泌以及阻断外泌体介导的细胞通信。
5. 可诱导性是其在再生医学领域的应用
此外，外泌体还具备引导细胞进行分裂和分化的能力，能够促使间充质干细胞（MSCs）分化为不同类型的细胞，从而替代受损组织中的细胞，为再生医学领域提供应用潜力。从人脐带间充质干细胞的条件培养液中提取的外泌体可以促进细胞增殖和迁移，抑制线粒体的凋亡信号通路，并且进而促进皮肤创面的修复。许多公司已经开发了基于外泌体的再生医学产品，这些产品广泛应用于伤口愈合、药妆产品以及美容领域。
外泌体研究的整体方案包括：
图 外泌体整体研究方案流程图
外泌体鉴定:
在《国自然研究热点—常青树—外泌体介绍I》的上一篇文章中，详细介绍了各种外泌体提取纯化的方法。在外泌体分离纯化后，需要进行表征鉴定，以评估纯化效果并确定获得的外泌体是否符合下游实验的需求。对外泌体进行鉴定的方法众多，分析指标多样，其中最重要的是检测外泌体的大小、形态和表面标志物。这也是国际细胞外囊泡学会（ISEV）建议对分离得到的外泌体进行的表征鉴定方法。
通过电子显微镜进行外泌体的大小和形态鉴定
通过使用扫描电镜 (SEM) 或透射电子显微镜 (TEM)等电子显微技术，我们可以直观地观察到粒子的形态，因此这些技术可以用于确定外泌体的存在和完整性。实验步骤如下：首先使用PBS溶液将提取的外泌体进行重悬，然后滴在孔径为2nm的载样铜网上，静置2分钟。接下来使用滤纸将液体从滤网侧边吸干，然后使用3%磷钨酸溶液进行负染，负染时间为5分钟。之后使用滤纸吸干负染液，待其室温晾干后进行电镜观察和拍照。在电镜下观察，外泌体具有清晰的膜边界，呈现出茶托或杯状的结构，大小在30~150nm之间（也可能存在小于200nm，并且较难鉴别出的其他形状的外泌体）。
图 电子显微镜检测外泌体形态
注：
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2、外泌体粒径和浓度的检测——纳米颗粒示踪分析 (NTA)
利用纳米颗粒跟踪分析仪, NTA技术可以检测外泌体的粒径和数量。操作步骤如下：将收集到的外泌体使用PBS稀释至106个/mL，然后使用1mL注射器将其注入样本室。通过装有摄像头的显微镜，激光光束穿过样本室来实现对外泌体颗粒的可视化，并记录外泌体颗粒的布朗运动。最后，根据运动方程计算外泌体的浓度和流体力学直径。与其他外泌体鉴定方式相比，NTA技术具有样本处理简单、能够更好地保持外泌体的原始状态以及更快的检测速度。
图 NTA检测外泌体粒径/浓度
3、外泌体表面标志物的鉴定——WB检测
外泌体生化分析主要通过检测其所携带的特异性蛋白标记物来进行鉴定，其中，WB检测是一种常用的分析技术，可以用于检测外泌体特定蛋白，例如四跨膜蛋白、肿瘤易感基因101蛋白、脂筏标记蛋白和凋亡诱导因子6相互作用蛋白等。为了对外泌体进行定性检测分析，我们可以参考标准的Western Blot（WB）操作方法，并利用外泌体特异性蛋白的抗体进行标记。
图 WB检测外泌体标志性蛋白
此外，还有其他方法可用于鉴定外泌体，包括ELISA、流式细胞术和质谱。这些方法常被用于检测外泌体的数量以及表面标志蛋白（如CD9、CD63、CD81）的表达。
外泌体定量检测试剂盒介绍：
本研究采用爱必信ELISA夹心法检测外泌体含量试剂盒(abs50054)。该试剂盒利用高性能抗CD9捕获和抗CD81检测抗体，能够灵敏且定量地检测人体体液或细胞培养上清液中共表达的外泌体表面标记CD9和CD81的靶标。通过该方法可以快速而精准地定量样本中完整的外泌体。
图 外泌体定量检测试剂盒原理
产品组分:
实验步骤:
1、试剂配制
所有试剂在使用前应在室温下平衡至少15分钟;
取浓缩洗液，使用蒸馏水或去离子水将20倍浓缩洗液稀释为1倍工作液，然后充分混合备用。
在进行检测前，将显色底物液A和B按照1:1的比例混合均匀使用。
2、实验过程
准备板条，并充分摇匀试剂；
2) 使用移液枪分别取100μL的SO-S5标准品，将待测样品分别加入微孔板中;
将板孔用封板膜封好，置于37°C下孵育60分钟;
将工作液洗液用300-350μL/孔的量进行3次清洗，然后用吸水纸吸干板孔中的残留液体;
每个孔中加入100μL的酶结合物。
将板孔用封板膜封好，温度设定为37°C，保持60分钟。
使用工作液对每个孔进行三次洗涤，每次洗涤量为300-350μL/孔，并在洗涤后使用吸水纸将其拍干;
将100μL显色底物液工作液加入反应孔中，在37°C的避光条件下进行30分钟的反应，在反应结束后加入50μL终止液，在酶标仪上以450nm波长进行读数，并绘制XY线性曲线。
3、校准程序
需要进行XY线性拟合，并且确保线性相关系数R2的值大于等于0.99。每次实验都必须进行完整的校准品操作，并制作相应的曲线图。
参考文献
[1] 史玉潇、芦晓红、卢望丁等人撰写的《外泌体的生物学性质及应用概述》发表于《中国医药工业杂志》2023年第54卷第7期，页码为1008-1019。DOI: 10.16522/j.cnki.cjph.2023.07.004。
[2] Wu Y, Deng W, Klinke DJ 2nd. Improved methods for characterizing the morphology, RNA content, and surface protein biomarkers of exosomes. Analyst. 2015 Oct 7;140(19):6631-42. doi: 10.1039/c5an00688k. PMID: 26332016; PMCID: PMC4986832.
Wang Y, Zhang L, Li Y, Chen L, Wang X, Guo W, Zhang X, Qin G, He SH, Zimmerman A, Liu Y, Kim IM, Weintraub NL, and Tang Y conducted a study titled 'Exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells deliver cardioprotective miRNAs and prevent cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium'. This study was published in the International Journal of Cardiology on August 1, 2015, with the volume number 192, pages 61-69. The study identified that exosomes/microvesicles from induced pluripotent stem cells can deliver cardioprotective miRNAs, thereby preventing cardiomyocyte apoptosis in the ischemic myocardium. The study also provided the digital object identifier (DOI) as 10.1016/j.ijcard.2015.05.020 and the publication dates of May 8, 2015 (electronic publication) and June 4, 2015 (print publication). The PMID and PMCID of this study are 26000464 and PMC4469495, respectively.
[4] Nan, D. Isolation and identification of extracellular vesicles from adipose-derived stem cells and their ex vivo study on delivering curcumin for anti-liver cancer purposes [D]. Dalian University of Technology, 2021. DOI: 10.26991/d.cnki.gdllu.2020.001248.
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