清华大学生命学院王宏伟课题组与北京大学彭海琳课题组合作开发石墨烯“三明治”技术用以制备冷冻电镜样品

样品制备已成为冷冻电镜技术解析生物样品高分辨率结构的主要限速步骤。在这个过程中，气液界面效应、背景噪音和优势取向等问题可能导致冷冻电镜结构解析失败，或者重复性较差。石墨烯，因其低背景噪音、高机械强度和高导电性等出色特性，被用作冷冻电镜样品制备支撑膜以提升样品质量。

2024年1月22日，清华大学王宏伟课题组和北京大学彭海琳课题组合作开发了一种基于石墨烯“三明治” 结构的冷冻电镜生物样品制备方法，以“石墨烯三明治技术用以生物冷冻电镜结构解析”（Graphene sandwich-based biological specimen preparation for cryo-EM analysis）为题发表于《美国科学院院报》（Proceedings of the National Academy of Sciences，PNAS）期刊。该研究通过在两层石墨烯间封装生物样品溶液，制备冰层厚度适宜的石墨烯“三明治”样品（图1），用以高分辨冷冻电镜重构。

常规石墨烯膜制备冷冻电镜样品的方法能够增加颗粒吸附，减轻气液界面带来的干扰。然而，石墨烯支持膜仅存在于冰层一侧，不能消除另一侧气液界面对样品的影响；并且在支撑膜亲水性不佳时，容易出现样品脱水的现象（图1a）。为解决这一问题，研究团队开发了一种石墨烯“三明治”技术，在生物样品溶液两侧都铺设石墨烯支持膜，对生物样品进行封装，进而制备冷冻电镜样品，从而彻底避免气液界面等问题的影响（图1b）。

  ▲图1.采用石墨烯作为支持膜的冷冻电镜样品制备示意图

在制备石墨烯“三明治”样品的过程中，先将生物样品溶液滴加到石墨烯电镜载网上，然后再将另一层石墨烯转移覆盖至上述载网表面。为解决上层石墨烯易于卷曲破碎而不便转移的问题，研究团队采用硬脂酸分子辅助石墨烯自支撑地悬浮在缓冲液表面，后将其转移至滴加样品溶液的石墨烯载网上。这种方法能够高成功率、高重复率地实现石墨烯“三明治”结构封装样品溶液。

和常规单侧石墨烯膜支撑的冷冻样品相比（图1a），这种石墨烯“三明治”结构有助于补偿因电子束照射而损失的二次电子，减小冷冻样品在透射电镜下的电荷积累效应。并且，由于石墨烯优异的机械强度，该方法还可以有效防止冰层形变，降低电镜成像过程中的颗粒漂移，从而进一步提高冷冻电镜照片的质量。采用这种方法制备冷冻样品，研究团队成功获得了成像质量更高的冷冻电镜数据，解析了去铁铁蛋白、20S蛋白酶体和新冠病毒刺突蛋白的高分辨冷冻电镜结构（图2）。

 ▲ 图2.石墨烯“三明治”结构应用于冷冻电镜结构解析

清华大学生命科学学院王宏伟教授、北京大学化学与分子工程学院彭海琳教授和清华大学生命科学学院刘楠博士为该论文的共同通讯作者，清华大学生命科学学院2019级博士生徐洁、北京大学化学与分子工程学院2020级博士生高啸寅、北京大学化学与分子工程学院郑黎明博士为该论文共同第一作者，清华大学生命科学学院2020级博士生贾霞、清华大学生命科学学院徐魁博士、北京大学工学院韦小丁教授及其研究生马瑜薇为该工作提供重要帮助。该课题得到了国家蛋白质科学研究（北京）设施清华基地冷冻电镜平台和计算平台的大力协助和国家自然科学基金、腾讯基金会以及清华大学水木学者计划的支持。

原文链接

 https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2309384121

转自：“水木未来资讯”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！