1、文献题目
Harmonizing Enzyme-like Cofactors to Boost Nanozyme Catalysis
文献期刊：Angew. Chem. Int. Ed.
10.1002/anie.202319108
2、文献作者
郭少军，北京大学博雅特聘教授、国家杰出青年基金获得者、国家重点研发计划首席科学家（燃料电池）、英国皇家化学会会士；吉林大学学士、中科院应化所博士、布朗大学博士后、美国阿拉莫斯国家实验室奥本海默杰出学者。长期致力于将国家重大需求与基础研究相结合，重点研究燃料电池、氢能与储能电池。发展了高性能原子、亚纳米和纳米催化材料设计的思想，提出了材料应变调控催化的新方式，率先揭示了材料本征拉应变和双轴应变调控催化材料电子结构与催化性能的化学机制，研制出了系列新概念电/光催化材料，显著提升了燃料电池和氢能催化性能，解决了能源小分子反应动力学慢的关键难题，有力推动了材料、化学和能源的交叉与融合。
3、文献提出的科学问题
与模仿特定金属因子而不使用其他支持性辅助因子的纳米酶相比，结合了多种纳米金属因子的金属有机框架显示出更强的过氧化物酶样活性。原子铁位点、连接体和氧化锆节点的协同作用促进了电子转移，为深入了解纳米酶催化作用提供了在原子尺度上构建催化口袋的见解。
4、分解为几个研究目标
1、以2,2′-联吡啶-5,5′-二羧酸（BPyDC）作为配位 Fe 的连接体，制备了 UiO-67-Fe。
2、通过3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）为电子供体，测试了 UiO-67-Fe 的过氧化物酶样活性。通过原位以及DFT计算NCF-1 的过氧化物酶样活性催化过程。
3、开发了一种用于检测毒死蜱的纳米酶联免疫吸附试验（NLISA）。NLISA 可检测 1.67-333.33 ng mL-1 范围内的毒死蜱，检测限为 0.46 ng mL-1，低于 ELISA（1.91 ng mL-1）。
5、研究总体方案
我们报告了一种具有原子分散铁位点的金属有机框架 UiO-67 纳米酶，它包含多种量身定制的类酶纳米因子，可协同驱动 ET 过程，从而增强过氧化物酶催化作用。其中，链接器耦合的原子铁位点在底物活化中起着关键作用，而裸链接器和氧化锆节点则促进了中间产物的电子传递效率(ET)。与单独使用基于金属位点的纳米因子相比，三种纳米因子的协同作用提高了 4.29 倍，有望在免疫测定中用于毒死蜱的灵敏检测。这一发现为通过在原子和分子尺度上协调各种纳米因子来设计高性能纳米酶开辟了一条新途径。
6、方法和技术手段
SEM、HAADF-STEM、XPS、同步辐射、In situ ATR-FTIR spectra
7、主要研究成果
1、选择了 2,2′-联吡啶-5,5′-二羧酸（BPyDC）作为配位 Fe 的连接体，制备了 UiO-67-Fe。X 射线衍射（XRD）图显示，在锚定铁位点后，生成的 UiO-67 的晶体结构保持良好。透射电子显微镜（TEM）图像显示八面体形态也没有受到影响。高角度环形暗场扫描 TEM（HAADF-STEM）和相应的元素图谱图像表明，所有元素分布均匀，没有聚集物种。通过电感耦合等离子体-光学发射光谱测定铁的含量≈0.89 wt %。在 N 1s 的 X 射线光电子能谱 (XPS) 谱图中，吡啶 N 峰的红移表明 Fe 位点被配体锚定。此外，Zr、C 和 O 的 XPS 峰几乎保持不变，这就排除了其他潜在配位形式的可能性。X 射线吸收近边缘结构 (XANES) 提供了对铁位点原子结构的深入了解。位于 FeO 和 Fe2O3 之间的 UiO-67-Fe（蓝色区域）的吸附阈值显示 Fe 的价态为 +2-+3。7113.45 eV 处的前沿峰来自四极允许的 1 s→3d 转变，表明 Fe 位点的八面体几何形状是扭曲的。相应的 R 空间扩展 X 射线吸收精细结构（EXAFS）验证了铁的原子分布，没有观察到铁-铁路径。在 EXAFS 的小波谱图中，6.79 和 9.60 Å-1 处的两个强度最大值分别对应于第一壳 Fe-N/O 配位和第二壳 Fe-C 配位，这表明铁以 Fe-BPy 的形式存在。UiO-67-Fe 的 EXAFS 拟合结果显示，Fe-N 间距约为 2.067 Å，这与羟基修饰的 Fe-BPy 优化理论模型中相应的键长（2.065 Å）非常吻合。在紫外/可见漫反射光谱（UV/Vis-DRS）中，≈590nm处出现的吸收也证明了羟基修饰的存在。
2、我们以 3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）为电子供体，测试了 UiO-67-Fe 的过氧化物酶样活性。氧化后的 TMB 的紫外-可见光谱在 652 纳米处显示出特征峰，证明了 UiO-67-Fe 的过氧化物酶样活性。与 HRP 相似，UiO-67-Fe 的活性与 pH 值有关，在 pH=3.5 时达到最大值。相比之下，UiO-67 的活性较低，表明 NCF-1 是主要的活性位点，KSCN 的抑制实验也证明了这一点。当用具有较大尺寸的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）取代 TMB 时，UiO-67-Fe 的活性降低，这表明催化作用是在催化袋中进行的，NCF-1 的有限进入提高了 UiO-67-Fe 的底物选择性。动力学实验表明，所有这些纳米酶都遵循 Michaelis-Menten 方程。UiO-67-Fe 对 H2O2 和 TMB 的质量活性分别是 UiO-67 的 76.23 倍和 55.78 倍。需要注意的是，工程化的 NCF-1 有效地将 H2O2 的Km从 14.27 mM 降至 1.20 mM，并略微影响了 TMB 的 Km。UiO-67-Fe 的过氧化物酶样活性主要归因于 NCF-1 激活了 H2O2。电子顺磁共振（EPR）实验，以确定加入 H2O2 前后 Fe 的价态变化特征。没有观察到特征性的 FeIII 参与信号，这反映出 NCF-1 可能遵循异解路径产生 FeIV=O 中间体，这些中间体与最初的低自旋 FeII 一起保持 EPR 沉默。原位衰减全反射傅立叶变换红外光谱（ATR-FTIR）在 931.5 和 863.4 cm-1 处出现两个峰，分别是吸附的 H2O2 的 O-O 伸展和 FeIV=O 中间体的振动频率，这验证了异溶解路径。引入的 H2O2 还在 EPR 光谱中产生了正交信号，这在 UiO-67 和 UiO-67-Fe 中都存在。根据 UiO-67 的模拟结果， gxx=2.0029、gyy=2.0095 和 gzz=2.0329是 ZrIV 捕获的超氧自由基（Zr-O2⋅-）的典型信号。另一个以 2.0030 为中心的各向同性共振源于生成的 BPy π-阳离子自由基（BPy⋅+），在 BPyDC+H2O2 中观察到的相同信号也证明了这一点。至于 UiO-67-Fe，由于受到 Fe 位点磁性的影响，该共振变宽并移至 g=2.0135，揭示了 BPy⋅+ 与 Fe 位点的耦合。这种以 FeIV=O 型和π阳离子自由基为特征的中间体与原生过氧化物酶的关键中间体化合物 I 相似但化合物 I 的形成过程不适用于此处。H2O2 的异解作用只能使最初的 FeII-BPy 转化为 FeIV=O(BPy)，BPy⋅+ 中间体的形成机制有待进一步研究。为了深入了解 NCF-1 的过氧化物酶样活性催化过程，我们进行了自旋极化 Kohn-Sham 密度泛函理论（DFT）计算。该结构是利用上述羟基修饰的 Fe-BPyDC 桥接两个 Zr 簇来建模的。首先，吸附在 NCF-1 上的 H2O2 要么同解为 *2OH 物种，要么异解为 *O-H2O。同解时，*2OH 物体随后从表面解离，形成 ⋅OH 和 *OH。在异溶解过程中，H2O 分子首先从 *O-H2O 中脱附，留下活性 *O。随后，*O 在外显质子的帮助下被单电子还原成 *OH。这两个过程在热力学上都是有利的，决定速率的步骤是 *OH+H+→*+H2O 。对于两种同时发生的路径，NCF-1 更倾向于杂解路径，因为杂解路径的活化能（0.27 eV）低于同解路径的活化能（1.93 eV）。鉴于异解路径可以很好地解释 FeIV=O 的形成，因此认为同解路径会产生 ⋅OH 和 BPy⋅+ 中间产物。电荷密度差分析表明，在形成 *OH 时，分子内 ET 从 BPy 到中心 Fe。UiO-67-Fe+H2O2 在水溶液中的吸光度光谱证实了这一过程。在引入 H2O2 后，吸光度随着时间的推移而增加，这表明催化过程中存在分子内 ET。这一现象表明，BPy 可以像化合物 I 中的卟啉一样向 Fe 位点提供电子。因此，FeIII-OH(BPy)中间体转化为 FeII-OH(BPy)⋅+，以进行后续催化，这与上述 EPR 光谱中未检测到的 FeIII 物种相吻合。如图所示，NCF-1 更倾向于通过异溶解程序形成 FeIV=O(BPy) 中间体，该中间体被一电子还原为 FeIII-OH(BPy)，并转化为 FeII-OH(BPy)⋅+ 以进行后续催化。此外，FeII-OH(BPy)⋅+还可以通过同解途径获得，另一个活性中间体是⋅OH。
3、以 5,5 二甲基-1-吡咯啉 N-氧化物（DMPO）为捕获剂，特征 EPR 信号验证了 ⋅OH 的存在，而其含量在 UiO-67 和 UiO-67-Fe 催化体系中均被抑制。当使用芬顿剂（Fe2++H2O2）作为⋅OH 的来源时，类似的抑制作用表明原因在于 NCF-2 的⋅OH 捕获能力（图 S16）。需要注意的是，在 BPyDC 存在的情况下，芬顿系统对 TMB 的氧化作用随着⋅OH 含量的降低而线性增强，这说明 BPy⋅+ 也能促进过氧化物酶样活性。然而，由于⋅OH 可直接氧化 TMB，因此从理论上讲，NCF-2 的 ET 过程似乎不利于过氧化物酶样活性。为了弄清 NCF-2 的作用机理，我们利用 Fenton 系统进一步探究了 ⋅OH 的反应性。值得注意的是，具有过度氧化性和高流动性的 ⋅OH 在实际应用中会不加区分地氧化多种物质，从而引发副反应。即使在如此简单的 TMB 体系中，选择不同的有机溶剂溶解 TMB 也会导致不同程度的副反应，其中溶剂的⋅OH 淬灭能力按照异丙醇≫乙醇≫二甲基亚砜（DMSO）的顺序排列。相应地，TMB 的氧化也受到抑制。加入 BPyDC 后，在所有溶剂中都能观察到活性的提高。因此，NCF-2 可以与溶剂竞争，与⋅OH 发生反应，从而抑制副反应。为了证实 NCF-2 在 UiO-67-Fe 中的作用，用 4,4′-联苯二甲酸 (BPDC) 取代 x%(x=10, 20) BPyDC 连接体，制备出 UiO-67(x%)-Fe，其中铁的负载量保持在≈0.90%。值得注意的是，配体替换后活性下降到原来的一半，这证明 NCF-2 对催化起了积极作用。在原位 ATR-FTIR 光谱中，NCF-1 的金属键吡啶峰（1605 cm-1）和 NCF-2 的羟基键吡啶峰（1585 cm-1）都随着反应时间的延长而降低，这与 BPy 活化为 BPy⋅+ 的过程相对应。鉴于 NCF-1 的异解路径会产生 *O-H2O，*H2O 可能是 NCF-2 被⋅OH 激活所致。根据上述现象，⋅OH与TMB 底物之间的 ET 过程受到溶剂干扰副反应的显著抑制，从而抑制了 UiO-67-Fe 的同解路径。幸运的是，NCF-2 可以与干扰物竞争，与⋅OH 发生反应，产生 BPy⋅+ 中间产物，从而增强过氧化物酶样活性。
4、NCF-3 的半导体特性进一步促成了光诱导 ET 过程，以协助 NCF-1 的活化。具体来说，照射下的预活化过程可显著增强 UiO-67-Fe 的过氧化物酶样活性（图 S19）。动力学实验表明，活化的 UiO-67-Fe 对 H2O2 具有更高的催化活性和亲和力。原位辐照 EPR 光谱用于监测活化过程。在有 DMPO 捕集剂存在的情况下，在黑暗条件下的前 10 分钟，EPR 信号可以忽略不计，直到开灯。然后，在接下来的 10 分钟照射中，⋅OH 迅速形成，并在关灯后衰减。结合上述 NCF-2 的机理，我们认为所产生的 ⋅OH 会将 NCF-2 激活为 BPy⋅+ 中间体。UiO-67-Fe+H2O2 的原位辐照光谱支持了这一假设。在 ≈3450 G 处的微弱变化表明 Zr-O2⋅-在辐照后的变化可以忽略不计。因此，≈3500 G 时的信号变化主要来自活化过程中 BPy⋅+ 中间体的形成。我们进一步分析了 UiO-67-Fe 的能带结构，以找到额外⋅OH 的来源。Mott-Schottky 测量表明，UiO-67-Fe 的导带（-0.20 V）低于 UiO-67（-0.07 V），这反映了 NCF-3 和 NCF-1 之间的 ET 过程。此外，时间分辨光致发光（TRPL）光谱测定的 UiO-67-Fe 平均荧光寿命较短，这表明 ET 过程较快。根据原位辐照 XPS 光谱，Fe 2p 的负移（-1.28 eV）进一步表明电子从 NCF-3 流向 NCF-1。根据上述分析，S 型异质结适用于描述 NCF-3 和 NCF-1 之间的相互作用。根据氧化还原电位，具有宽带隙的 NCF-3 可催化 H2O 氧化，并将电子传递给 NCF-1 使其还原 H2O2，从而产生 ⋅OH 将 NCF-2 活化为 BPy⋅+ 。
5、简而言之，UiO-67-Fe 的催化机理见图。NCF-1 是过氧化物酶类活性的主要活性位点。它能同时实现 H2O2 的异解和同解，形成 FeIV=O(BPy)、FeII-OH(BPy)⋅+ 和⋅OH 中间产物。NCF-2 与⋅OH 经历 ET 过程，生成 BPy⋅+ 中间体，从而抑制了有机溶剂干扰的副反应。NCF-3 还具有光活化能力。它能促进 NCF-1 的同解途径，并产生额外的⋅OH 来激活 NCF-2 生成 BPy⋅+中间体。因此，与单独的 NCF-1 相比，三种 NCF 的协同作用使催化速度提高了 2.69 倍，H2O2 亲和力提高了 1.54 倍，每个 NCF-1 的比活性达到 864.00 M-1 min-1，是 NCF-1 固有活性（201.18 M-1 min-1）的 4.29 倍。在没有辐照的正常条件下，与 NCF-2 合作也能将比活度提高到 426.96 M-1 min-1。UiO-67-Fe 令人满意的过氧化物酶样活性进一步促使我们打破现有基于酶的应用的局限性。具体来说，酶联免疫吸附试验（ELISA）作为过氧化物酶最典型的应用之一，是验证 UiO-67-Fe.7 应用潜力的理想应用平台、利用 UiO-67 中的 Zr 物种通过形成 Zr-O-P 键对磷酸盐具有高亲和力的优势，我们用 UiO-67-Fe 替代 HRP 标记的抗体，开发了一种用于检测毒死蜱的纳米酶联免疫吸附试验（NLISA）。NLISA 可检测 1.67-333.33 ng mL-1 范围内的毒死蜱，检测限为 0.46 ng mL-1，低于 ELISA（1.91 ng mL-1）。对 NLISA 系统预照射 6 分钟可使灵敏度进一步提高一倍，检出限降低到 0.21 ng mL-1。这两条曲线都能满足美国环保署报告的检测要求，即农产品中毒死蜱的残留量应低于10 ng mL-1。以一些常见的污染物作为干扰物，毒死蜱的特异性反应证明了其高选择性。此外，与 ELISA 相比，NLISA 显示出更高的稳定性。利用全面改进的优势，NLISA 成功地应用于检测实际农产品中的毒死蜱。
8、作者给出结论
1、报告了一类具有卓越过氧化物酶样活性的 UiO-67-Fe 纳米酶，其中多个协同 NCF 参与加速 ET。
2、NCF-1 是 H2O2 异解活化和同解活化的主要结合位点，可产生 FeIV=O(BPy) 中间体和 ⋅OH 中间体；NCF-2与⋅OH的反应先验性高，可与干扰物竞争产生BPy⋅+中间体，进一步氧化目标底物，引导ET，抑制副反应；NCF-3带来光诱导ET，促进NCF-1的同源分解路径，其中更多形成的⋅OH中间体与NCF-2相互作用，实现光激活功能。
3、NCF-2 和 NCF-3 单独不能表达过氧化物酶样活性，但它们与 NCF-1 配合使用，能协同提高 ET 效率，使过氧化物酶样活性比单独使用 NCF-1 提高了 4.30 倍。重要的是，在毒死蜱的免疫检测中，这种纳米酶实现了对天然 HRP 和抗体的替代，其 LOD 低至 0.21 ng mL-1。
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