斑马鱼能够再现KARS1双等位基因突变所导致的神经发育障碍和听力损失

氨基酰- tRNA合成酶(ARSs)是将特定氨基酸氨基酰化到其同源tRNA上所必需的酶。ARS基因中的双等位基因突变已被证明可导致多种严重和早发性人类疾病。人类的37个ARS基因中，18个编码细胞质酶，17个编码线粒体酶，2个编码双功能酶，KARS1(lysyl-tRNA合成酶)是双功能ARS酶之一，编码细胞质和线粒体赖氨酸- tRNA合成酶，这两种合成酶是由选择性剪接产生的。已有研究表明，KARS1双等位基因突变的患者临床表现包括肌萎缩、非综合征性听力损失、周围神经病变、先天性视力障碍、进行性小头症、肥厚性心肌病、脑白质病变、脑白质营养不良和严重神经感觉疾病伴视神经病变。

2021年6月发表在Genetics in Medicine 杂志的“Biallelic

variants in KARS1 are associated with neurodevelopmental

disorders and hearing loss recapitulated by the knockout zebrafish”文章发现斑马鱼可以再现KARS1双等位基因突变所导致的视觉障碍、神经肌肉功能障碍和听力损失，为探索KARS1双等位基因突变疾病的治疗方法提供了新的思路。

作者调查了16个不相关家庭，其中22个受影响个体都具有KARS1双等位基因突变。临床上大多表现为中度至重度发育迟缓，进行性神经和神经感觉障碍、脑白质受累、发育倒退、智力残疾、行为异常等。

为揭示KARS1的功能，作者通过WISH检测了斑马鱼胚胎发育过程中kars1的表达。结果显示kars1在发育初期是普遍表达的，随后逐渐高表达在中枢神经系统、眼睛、内耳、肌肉和消化系统(肝脏、肠道和胰腺)中。接着，作者利用CRISPR/Cas9构建了三个kars1功能缺失的斑马鱼突变系：kars1om1del7、kars1om2del8和kars1om3del7。与WT相比，kars1−/−在3dpf时表现出心脏水肿、头部、眼睛和耳泡变小、鱼鳔充气异常以及躯干肌肉纤维异常，三种kars1−/−的死亡率均为100%。与WT相比，kars1−/−的眼睛和头轴长显著减小，对触摸没有反应，并丧失运动方向。从侧卧图可以观察到突变体出现前庭功能丧失、严重的肌肉控制障碍以及鱼鳔充气异常，这些都会影响鱼体平衡。由于突变体在眼睛和耳朵上表现出形态缺陷，并且对触摸没有反应，作者进一步量化了它们的视觉惊吓行为反应（VSR）和听觉诱发行为反应（AEBR），发现其在对光或声惊吓的反应中完全丧失运动能力。总之，kars1−/−在眼睛、内耳和躯干肌肉中出现的组织/器官特异性形态缺陷似乎与胚胎发育期间kars1的表达模式直接相关，这强烈表明以上表型和行为是由kars1功能丧失引起的。同时作者通过注射 kars1 mRNA进行了拯救实验，发现突变体心脏水肿的频率降低、眼睛大小以及惊吓反应也得到恢复，再次证实以上结论。

5dpf斑马鱼幼鱼大脑的组织学分析显示，与WT相比，kars1−/−的大脑出现空泡状海绵体，细胞密度降低，节段边界紊乱；眼体积减小，视网膜层组织完全丢失；大脑和视网膜中的神经元细胞数量明显减少；神经元突触的免疫组织化学分析显示，大脑和眼睛区域的染色减少，突触显著减少，表明神经元传递受损。此外，染色显示突变体运动神经元形态异常，包括突变体中运动神经元轴突突起缩小和末端轴突分支减少，进一步表明其运动功能受到严重影响。

WISH数据显示kars1 mRNA在躯干肌肉中表达，而触摸kars1−/−无法诱发运动。标记肌动蛋白的Phalloidin在肌组中显示较弱的染色，并且肌腱连接处(MTJ)的肌纤维错位和脱落，表明突变体运动不协调是严重的神经肌肉功能障碍导致的。一些携带KARS1变异等位基因的个体也表现出听力障碍，这与突变体中观察到的内耳缺陷相似。形态学分析显示，突变体的耳泡和耳石变小，前后黄斑的感觉上皮变平。静纤毛对内耳听毛细胞束的形成和机电转导至关重要，而内耳的Phalloidin染色显示富含F-肌动蛋白的静纤毛数量明显减少。综上所述，kars1在斑马鱼内耳听毛细胞形成中起着至关重要的作用，这与KARS1突变个体中发现的听力障碍表型相一致。因此通过形态学、行为学和组织学分析，作者得出结论：kars1−/−突变体幼鱼表现出视觉障碍、神经肌肉功能障碍、听力损失，再现了KARS1突变患者中的部分表型。

为确定Kars1功能丧失对基因表达的影响，作者对WT和kars1−/−进行了rna测序(RNA-Seq)。KEGG通路分析显示，kars1功能缺失导致包括p53和细胞凋亡通路在内的许多通路失调。为检测在kars1−/−中发现的形态缺陷是否是由于细胞异常凋亡引起，作者进行了TUNEL实验，发现在5 dpf时，与对照组相比，kars1−/−的大脑、眼睛、躯干和内耳中TUNEL阳性细胞增加，表明不同的细胞类型对kars1的缺失都很敏感。接下来，为了确定p53激活是否介导了细胞凋亡的增加，作者在kars1−/−中进行tp53 MO，随后在3dpf进行TUNEL实验。结果显示，在注射MO的kars1−/−中，脑、眼、耳和躯干的tunel阳性信号显著减少。眼睛大小和几种凋亡标志物的表达恢复到WT水平，从而证实p53通路被成功敲低。为了进一步表征抑制p53通路后在分子水平上的功能挽救，作者检测了在kars1−/−中下调的6个基因的表达，发现在kars1−/−中p53敲除后，这6个基因部分恢复了表达。综上所述，Kars1的缺失上调了p53通路，从而导致细胞凋亡，进而导致多种表型异常。

为了验证这一发现，作者使用CRISPR/Cas9技术同时敲除kars1和tp53基因。注射kars1 mRNA可挽救这些表型，证实上述表型是由kars1功能丧失引起的。注射tp53 sgRNAs恢复了kars1 F0突变体眼睛和头部的大小。此外，90%的kars1 F0死于10 dpf，而注射kars1 mRNA或tp53 sgRNAs后只有20%死于10 dpf。组织学分析显示，与kars1 F0突变体相比，kars1；tp53 F0突变体的脑内空泡状海棉体外观明显恢复，眼体积和视网膜层组织也明显恢复。综上所述，kars1 F0突变体表现出kars1−/−的表型，而p53缺失减轻了由于kars1缺失而导致的形态、行为和分子表型。

文章来源于生物学

转自：“博舜科研”微信公众号

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