以下文章来源于龙师兄实验室 ，作者龙师兄实验室
缘由：
在IVD领域，ELISA技术已逐渐被其他快速灵敏，操作简单的技术取代了，目前基本上就保留传染病初筛项目。但是在科研市场，ELISA还处于绝对的垄断地位，其原因是科研测定指标多，物种多，客户群体分散，市场规模小。据于此，目前最有可能取代科研ELISA是单人份的化学发光。
ELISA简介：
酶联免疫吸附测定法 (enzyme-linked immunosorbent assay)，简称 ELISA，是用于检测微量物质的固相免疫测定方法，是继免疫荧光和放射免疫技术之后发展起来的一种免疫酶技术。自1971年问世以来，发展十分迅速，已成为是免疫学和分子生物学中广泛使用的实验室技术。
ELISA的原理：利用抗原抗体的特异性反应，结合酶对底物的催化作用，来检测目标物质的含量。测定时，需要将抗原或捕获抗体包被于固相载体上，然后将目标物质与固相载体表面的抗原或抗体结合在一起，通过洗涤将抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开，再加入酶标记的抗原或抗体形成复合物，通过酶催化底物产生颜色反应，将化学信号转换为电信号，通过测量OD值对目标物质进行定量分析。
ELISA的历史：
1960年，美国科学家Rosalyn Yalow（1921～2011）和 Solomon A. Berson（1918～1972）在研究糖尿病时，第一次使用I-125 标记胰岛素测量糖尿病患者尿液中的胰岛素水平，解决了之前难以测定的微量生物活性物质的临床检测问题（Yalow R S, Berson S A. Immunoassay of endogenous plasmainsulin in man[J]. Clin Invest, 1960, 39(1): 1157-1175）。Yalow 也因发明 RIA（放射免疫分析radioimmnuoassay）技术获得 1977 年诺贝尔生理学或医学奖，但遗憾的是，Berson 已经于 1972 年去世了。
RIA 技术被发明以后，由于放射性同位素的安全性风险太高，科学家便想用生物酶来代替放射性标记，在不影响酶与抗体或抗原活性的前提下实现二者的连接进而取代放射性标记。终于在1971 年，两个独立的研究团队设计建立了 ELISA 检测技术。
1971年，瑞典斯德哥尔摩大学的Eva Engvall 和Peter Perlmann 在《Immunochemistry》上发表了以碱性磷酸酶为标记的ELISA（酶联免疫吸附试验, enzyme-linked immunosorbent assay）论文（Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 1971, 8(9):871-874）。
同年，荷兰Organon 实验室的 Bauke van Weemen 和Anton Schuurs在《FEBS Letters》上也报道了使用丙二醛连接辣根过氧化物酶作为标记物的EIA（酶免仪分析技术enzyme immunoassay）技术（Weemen BKV, Schuurs AHWM. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Letters. 1971, 15(3):232-236）。
ELISA的基本流程：
包被：通过吸附将抗原或抗体固定到96板孔的内表面上。
封闭：添加无关蛋白质或大分子聚合物以封闭96板孔内所有未饱和的结合位点。
孵育：与抗原或捕获抗体特异性结合的抗体或抗原进行孵育。
洗涤：洗涤非特异性吸附杂质。
检测：通过酶标抗原或抗体催化底物产生信号。
ELISA的分类：
ELISA 既可测定抗原，也可以测定抗体，其中包括三个必要试剂：
(1)包被在固相的抗原或抗体(免疫吸附物)
(2)酶标记的抗原或抗体(标记物)
(3)酶反应的底物（显色剂）
根据试剂的来源和标本的情况以及检测条件， 可设计出各种不同类型的 ELISA 检测方法，主要有以下几种类型：
1.直接法（direct ELISA，1971）
1971年，直接ELISA法由瑞典斯德哥尔摩大学的Eva Engvall 和Peter Perlmann（Engvall E, Perlmann P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 1971, 8(9):871-874）以及荷兰 Organon 实验室的 Bauke van Weemen 和Anton Schuurs（Weemen BKV, Schuurs AHWM. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Letters. 1971;15(3):232-236）设计发明。
直接ELISA法是将抗原固定在96孔板上，然后用酶标抗体直检测抗原。直接ELISA实验步骤少，检测速度快，不需要用到二抗，避免了交叉反应，测定结果不容易出错。但是由于直接ELISA的抗原通过吸附而不是特异性固定的，样本中的所有蛋白质（靶蛋白及其他杂质蛋白）都会固定在96孔板上，导致背景比较高。而且直接ELISA每种靶蛋白都需要标记与其特异性结合的一抗，实验显得不太灵活。另外由于没有使用二抗，没有放大作用，降低了测定的灵敏度。
优势：实验步骤少，检测速度快，因无须使用二抗可避免交互反应。
缺点：试验中的一抗都得用酶标记，但不是每种抗体都适合做标记，费用相对提高。
2.间接法（indirect ELISA，1978）
1978年，间接ELISA法由芬兰赫尔辛基奥罗拉医院的 Lindström 和Wager 为检测人血清中的白蛋白引入二抗而建立（Lindström, P. et al. IgG autoantibody to human serum albumin studied by the ELISA-technique. Scand J Immunol. 1978, 7(5):419-425）。
在direct ELISA 方法基础上，Lindström 和Wager 引入二抗建立了indirect ELISA 方法，通过使用一抗能结合多个二抗，从而放大了检测灵敏度，同时，不需要标记一抗，只需要加入抗一抗种属的标记二抗就可以进行检测，克服了direct ELISA 的局限性。
优点：只要更换不同的固相抗原，就可以用标记二抗检测各种与抗原相结合的抗体，二抗可以加强信号，不加标记一抗体则能保留一抗最多的免疫反应性。
缺点：存在交叉反应的可能性，抗原纯度不够会导致非特异结合，产生假阳性。
3.双抗体夹心法（sandwich ELISA，1977）
1977 年，双抗体夹心法由日本宮崎大学医学部和德岛大学的研发团队设计发明，利用包被的兔 IgG 检测目标蛋白（Kato K, Hamaguchi Y, Okawa S, et al. Use of rabbit antibody IgG bound onto plain and aminoalkylsilyl glass surface for the enzyme-linked sandwich immunoassay. J Biochem. 1977, 82(1):261-266）
Sandwich ELISA法结合了direct ELISA和indirect ELISA 技术特点，sandwich ELISA的灵敏度高，它比直接或间接ELISA敏感2-5倍，同时sandwich ELISA使用两种特异性抗体与抗原结合，拥有很高的特异性，另外sandwich ELISA能够通过直接或间接的方式进行检测，具有灵活性。
Sandwich ELISA原理：将捕获抗体固定在96孔板上，加入样品，通过捕获抗体结合目标抗原，洗去未结合的杂质后，加入酶标检测抗结合目标抗原的另一表位（如果检测抗体不带有标记，则需使用酶标二抗与检测抗体结合，这种称为间接夹心ELISA），形成“sandwich” 的结构，此时的抗原就像被两个面包片夹着的奶油，通过酶催化发生显色反应就可以测定抗原的含量。
双抗体夹心法测抗原，对抗原分子上两个不同抗原决定簇的单克隆抗体分别作为捕获抗体和酶标检测抗体。适用于测定二价或二价以上的大分子抗原，不适用于测定半抗原及小分子单价抗原，因其不能形成两位点夹心。
优点：高灵敏、高专一性，抗原无须事先纯化，进行操作时不需稀释，夹心ELISA尤其适用于复杂样品的分析，因为抗原不经纯化仍具能有高灵敏度和特异性。
缺点：抗原分子上需拥有两个不同抗原决定簇，对配对抗体要求很高，如果没有标准化的试剂盒或者已经通过测试的配对抗体，则需要进行配对抗体定制并进行优化，因为降低捕获抗体与检测抗体之间的交叉反应是非常重要的。
4.双抗原夹心ELISA
反应模式与双抗体夹心法类似。将捕获抗原和酶标检测抗原分别取代捕获抗体和酶标检测抗体，就可用双抗原夹心法测定样品中的抗体。
优点：该方法不受非特异性IgG的干扰，背景干扰小，受检抗体不需要稀释。
缺点：技术难度较高，需要制备高质量的酶标抗原。
5.竞争法（competitive ELISA，1976）
1976 年，竞争ELISA法由威斯康星医学院的 Donald E. Yorde 和 John C. Garancls 用于人绒毛膜促性腺激素的检测而建立（Yorde DE, Sasse EA, Wang TY, Hussa RO, Garancis JC. Competitive enzyme-linked immunoassay with use of soluble enzyme/antibody immune complexes for labeling. I. Measurement of human choriogonadotropin. Clin Chem. 1976, 22(8):1372-1377）。
Competitive ELISA 方法是所有ELISA 里最为复杂的测试方法，通过检测竞争信号的强度来反应样品中的抗原水平，通常以酶标抗原作为竞争抗原，与样品来源的抗原形成直接竞争，抢夺过量的固定化抗体上的结合位点，因此竞争信号越高，说明样品中的抗原越少。
竞争ELISA既可用于检测抗体，也可用于检测抗原。以检测抗原为例，将捕获抗体固定在96孔板上，然后将待测抗原样本和酶标抗原混合，一起加入到孔中，待测抗原与酶标抗原竞争结合在固相抗体上。通过洗涤除去未被结合的抗原，最后加底物显色，显色结果与待测抗原的量成反比。
优点：可用于检测不纯的样品，且数据再现性高，特异性好。
缺点：操作方法更复杂一些，产品性能取决于抗体的亲和力。整体的敏感性和专一性都较差。
几种ELISA法的优缺点：
ELISA试剂盒的选择
在选择 ELISA 试剂盒时，不同的用户往往有不同的选择标准，无论是灵敏度、样本类型还是简便性，核心标准是 ELISA 试剂盒的重现性。
1）试剂盒的应用种属、检测样本的种类
一般来说，生产厂家都会在产品名称上标明种属，ELISA试剂盒种属:人、小鼠、大鼠、兔、猴等。待检样本种类：体液、血清、血浆、细胞培养上清液、尿液、组织匀浆等。
2）试剂盒的检测范围
也就是标准曲线范围，特别要注意待测样本浓度是否落在标准曲线范围内，对于高浓度样本，需要先进行预实验摸索到比较好的稀释倍数后再大量测定样本。
3）特异性
特异性简单来说就是阴性样本的阴性检出率，与试剂盒的关键组分—抗体对有关，确保抗体对杂质无交叉反应，交叉反应越小，特异性越好。，具体要求是试剂盒尽可能采用单抗，若抗体对中之一为多抗，另一个必须为单抗。
4）灵敏度
灵敏度简单来说就是阳性样本的阳性检出率，反映的是试剂盒对于被检物质的最低检测能力。如果待测样本浓度很低，则需选择高敏的ELISA试剂盒。
5）精密性
又称重复性，是对同一样品重复测定时误差大小的评估参数。科学实验讲求重复性，一般而言，ELISA试剂盒，其板内和板间变异系数，国产试剂的变异系数在20％内，进口试剂在15％内。
6）回收率
将已知的低、中、高浓度的标准品掺入到待测样本中，掺入前后测到的浓度增加部分与掺入浓度之比就是回收率，以此验证检测的准确度。ELISA试剂盒回收率通常在80-120%之间。
7）稀释线性
公认的实验线性：样本稀释后，最终分析物浓度应该相同。在天然样本基质中添加有适当浓度的标准品，分别稀释不同倍数，测定各浓度下的回收率，线性通常介于80-120%之间。
8）稳定性
稳定性是试剂盒必需的基本属性，是指试剂盒在有效期内和规定条件下保持其性能的能力，一般有效期稳定性、运输稳定性以及冻融稳定性。一般以加速破坏性实验进行验证，将未拆封的试剂盒在37°C和2-8°C分别放置一定时间，考察各项性能指标的偏差，以偏差小于10%为合格。稳定性越好，试剂盒存储时间越长。
9）简便性
试剂盒在保证高质量数据的情况下，实验时间越短，操作越便利越好。
10）品牌
一个品牌反映的不仅是产品质量的问题，更反映优质的售前售后服务。常见的高美誉度品牌进口的有R&D、BioLegend、Abcam、Raybiotech和MyBioSource等，国产的Elabscience，华美等也还不错。
11）文献引用
产品的文献引用特别是高质量的SCI文章引用是业界对产品认可的一个非常重要指标，对科研实验有一定的参考作用。
转自：“医学科研小坑”微信公众号
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