【学术笔记】哺乳动物神经系统中的表观转录组调控
记录人：杨越奇 李毓龙实验室
2023年12月19日中午，受生命科学联合中心邀请，于翔教授主持，来自美国宾夕法尼亚大学的Hongjun Song（宋红军）教授在北京大学金光生命科学大楼101报告厅带来了一场题为“Epitranscriptomic regulation in the mammalian nervous system”的精彩报告，来自北大、清华近200余老师、学生参加了学术报告（图1）。
图1 Hongjun Song教授做报告与交流
【概要】
对超过170种化学上不同类型的RNA修饰或者表观转录组学的研究引起了学术界极大的兴趣，这是因为它在RNA生物学的几乎每个方面都有关键作用，调节从发育到癌症的各种生物学过程，也因为RNA修饰提高了COVID-19 mRNA疫苗的疗效并且降低了其免疫原性，而在临床应用中取得了巨大成功。人们在发现针对不同RNA修饰的写入、阅读、擦除蛋白方面取得了快速进展，这反过来又为研究它们的生物学功能和潜在机制，以及开发针对不同疾病的潜在治疗策略提供了切入点。Hongjun Song教授课题组通过动物模型的体内实验和人脑类器官的体外实验，研究了表观转录组调控在成年哺乳动物神经系统中的作用和机制，包括轴突再生、学习和记忆、成年发病的肥胖症和渐进性神经退行性疾病。Song教授重点介绍了通过这些研究发现的意想不到的生物学原理。
【精彩回顾】
DNA和组蛋白水平上的不同修饰引起了表观基因组的变化，从而影响基因的表达。细胞中存在特定的写入（writers）、阅读（readers）和擦除（erasers）蛋白，能够识别相应的修饰（见图2）。类似地，RNA水平上也存在超过170种化学修饰，构成了表观转录组（epitranscriptome）水平的丰富变化（图2）。其中，m6A这种重要的RNA修饰也存在METTL3、METTL14等写入蛋白，YTHDF1-3等阅读蛋白，以及ALKBH5、FTO等擦除蛋白（图2）。
图2 基因表达调控的多个层级1
表观转录组水平的变化调控了许多关键的生理和病理过程，因此被学术界广泛关注。例如，今年的诺贝尔生理或医学奖就颁发给了发现可以通过RNA修饰来提高mRNA疫苗的效率和稳定性，并且使得抗击新冠肺炎的高效mRNA疫苗研发成为可能的两位科学家Katalin Karikó和Drew Weissman。他们在宾夕法尼亚大学的同事Hongjun Song教授和Guo-li Ming教授课题组则在近几年来重点关注了表观遗传学和表观转录组学在发育中和成熟的哺乳动物神经系统中的重要功能。
m6A修饰依赖的mRNA降解在哺乳动物皮层神经发生过程中的时间控制作用
首先，Song教授为大家讲授了他们课题组于2017年在Cell杂志上发表的论文，题为“Temporal Control of Mammalian Cortical Neurogenesis by m6A Methylation”2。
在哺乳动物大脑皮层神经发生的过程中，神经上皮细胞（neuroepithelial cells）首先进行对称分裂，之后转化为放射状胶质细胞（radial glial cells, RGCs）。RGCs承担了初级神经前体细胞（neuro progenitor cells, NPCs）和神经元迁移骨架的双重职能，后续通过逐步的增值和分化形成神经元和胶质细胞。为了研究m6A在皮层神经发生中的作用，Song教授团队的研究者利用Nestin-Cre:Mettle14f/f小鼠模型特异性地在发育的神经系统中敲除了高表达的m6A写入酶Mettl14。他们发现条件性敲除（cKO）小鼠在出生后第5天（P5）比野生型同窝鼠体型小，且在出生后25天内全部死亡（图3A）。这说明在胚胎神经系统中表达Mettl14是生存所必须的。之后，研究者着重分析了P5小鼠的皮层结构，发现cKO小鼠的脑室附近存在大量Pax6和Nestin阳性的神经元；而在野生型小鼠P5中，Pax6阳性神经元则很少（图3B-D）。Pax6和Nestin是RGCs的标记物，这说明cKO小鼠在p5仍存在具有分化能力的RGCs。
图3 胚胎神经系统表达的Mettl14对小鼠生存是必要的
为了探究cKO中RGCs细胞持续存在的原因，研究者使用EdU标记胚胎期E17.5的处于细胞周期S期的神经元，发现2小时后M期标记物pH3阳性的EdU+Pax6+细胞在cKO小鼠中比例明显变高（图4A）。这表明cKO小鼠从S到M期的转变延长了。而24小时后细胞增值的标记物Ki67阴性的细胞比例在cKO小鼠中明显下降（图4B）。这些结果表明Mettl14敲除的小鼠胚胎的皮层RGCs的细胞周期受阻，细胞分裂时间变长。
图4 胚胎神经系统RGCs的Mettl14缺失导致细胞周期缺陷
进一步的，为了探究m6A修饰影响皮层神经发生的分子机制，研究者使用了m6A测序（m6A-seq）来检测在胚胎期E13.5（一个神经干细胞富集的时期）存在m6A修饰的转录本。研究者发现，许多被m6A修饰的mRNA都编码转录因子，例如Pax6、Sox1、Sox2、Emx2、Neurog2等（图5A）。下游的基因功能分析进一步表明这些m6A修饰的转录本在细胞周期、干细胞和神经元分化的通路中富集（图5B）。那么，m6A修饰对基因表达有什么影响呢？研究者利用actinomycin D来暂停E13.5小鼠的基因转录，并通过RNA-seq来分析转录本的稳定性。结果发现，野生型小鼠m6A修饰的转录本的比例明显低于非m6A修饰的转录本，这种差异则在Mettl14 cKO小鼠中减小（图5C）。这些结果支持了一个模型：在与细胞周期和神经发生相关的mRNA上的m6A修饰促进了这些转录本在皮层神经发生的动态过程中的快速周转。如果m6A缺失，会导致这些mRNA的降解变慢，从而影响神经前体细胞的时间特异性和细胞周期的持续性。
图5 m6A修饰的转录本与胚胎期小鼠大脑的转录因子、细胞周期和神经分化相关，并能促进转录本的降解
考虑到m6A修饰转录本富集到与神经元产生和分化相关，例如中间前体细胞（intermediate progenitor cells, IPCs）的标记物Tbr2和神经元的标记物Neurod1都被m6A修饰（图6A）。而根据领域内的共识，神经干细胞并不会表达这些基因。为了解释这个矛盾，研究者提出两种可能性：在正常情况下这些神经元谱系相关的基因就已经在神经干细胞中转录，只不过后续的表达被转录后的m6A修饰所抑制；还是正常情况下这些基因并不在神经干细胞中转录，但Mettl14的敲除上调了这些基因的转录呢？为了区分这两种可能，研究者使用4-硫代尿苷（4sU）标记了新生的mRNA，发现相比野生型NPCs，Mettl14 cKO小鼠的NPCs的Tbr2和Neurod2等基因的转录水平与之相当，甚至更低（图6B）。因此，结果推翻了后一种假说，支持前一种假说。研究者将这个现象总结为在哺乳动物皮层神经发生过程中存在的一种转录预模式（prepatterning）的机制，即后期IPCs和神经元谱系的基因已经在皮层神经干细胞中转录，但这些转录本被m6A修饰从而被下调。这个发现挑战了领域内先前认为神经干细胞不表达神经元谱系基因的共识。
图6 转录后m6A修饰下调了RGCs中过早转录的神经元谱系基因的mRNA
先前的结果都仅是在模式动物小鼠中的研究，那么对于人类而言，m6A修饰是否也有类似的作用呢？研究者利用了人诱导多能干细胞（iPSC）体外分化得到了人类皮层NPCs，并用shRNA敲低了这些细胞中的METTL14，结果显示，敲低组的分裂细胞数量明显低于对照组，表明在METTL14敲低的人类NPCs中，也存在细胞周期推迟的现象（图7A），与在小鼠中的结果类似（图4）。此外，Song教授课题组在2016年时曾发展了一种用人iPSC诱导产生前脑类器官模型的方法3。利用这个类似人胚胎皮层的类器官模型，研究者同样利用shRNA敲低METTL14，结果与体外培养的细胞一致（图7B）。这些结果表明，m6A修饰对于NPC细胞周期进程的调节作用在人和小鼠中是保守的。
图7 METTL14调节人源NPC的细胞周期进程
最后，研究者还比较了小鼠和人皮层神经发生过程中m6A修饰转录本的差异。他们发现m6A修饰似乎在人类中更为普遍（图8A）。值得注意的是，高达1173个转录本在人类样品中存在m6A修饰，但在小鼠中不存在。对这些转录本进行基因功能分析，研究者发现它们与精神障碍和精神发育迟滞相关（图8B），其中许多都是自闭症谱系障碍（ASD）和精神分裂症（SCZ）的风险基因（图8C）。
图8 m6A表观转录组在人类和小鼠皮层神经发生中的保守与差异
总而言之，Song教授课题组分析了小鼠和人类皮层神经发生过程中神经干细胞内的m6A修饰，发现编码神经元谱系的转录因子的基因已经在神经干细胞中转录，并作为一种表观转录组的调控，下调这些转录本。他们提出了一种新的预模式机制：表观转录组的变化提供了神经发生时转录组变化的速度与灵活性（图9）。
图9 神经发生过程中的预模式1
Mettl16依赖的m6A修饰及其读取蛋白Ythdc1保护胚胎皮层神经发生过程中基因组的完整性
随后，Song教授还向大家分享了他们课题组近期一项未发表的工作，涉及Mettl16依赖的m6A修饰通过独特的分子生物学过程促进了DNA损伤修复，保护了哺乳动物胚胎皮层神经发生过程中发生的大量DNA损伤。由于工作还未发表，这里不便详细展示。
参考文献
1.Yoon, K.-J., Vissers, C., Ming, G. & Song, H. Epigenetics and epitranscriptomics in temporal patterning of cortical neural progenitor competence. Journal of Cell Biology 217, 1901–1914 (2018).
2.Yoon, K.-J. et al. Temporal Control of Mammalian Cortical Neurogenesis by m6A Methylation. Cell 171, 877-889.e17 (2017).
3.Qian, X. et al. Brain-Region-Specific Organoids Using Mini-bioreactors for Modeling ZIKV Exposure. Cell 165, 1238–1254 (2016).
转自：“生命科学联合中心”微信公众号
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