Nature｜艰难梭菌铁质体适应营养免疫的机制

以下文章来源于北京生物结构前沿研究中心 ，作者娄鑫垚

铁对几乎所有形式的生命都是必不可缺的，但铁含量过高就会中毒1。为了在宿主体内生存，细菌病原体进化出了铁的摄取、储存和解毒策略，以维持铁稳态2。最近的研究表明，三种革兰氏阴性厌氧菌会产生铁质体颗粒3。然而，尚不清楚铁质体是否完全由革兰氏阴性菌所产生。艰难梭菌是一种革兰氏阳性芽孢厌氧菌，其对全球公共卫生构成巨大挑战4。即使接受治疗，艰难梭菌感染（CDI）的复发率仍为20-25%5，因此开发新的针对 CDI的治疗策略至关重要。

艰难梭菌的发病机制依赖于其获取营养金属进行定植和增殖的能力6。为了抑制微生物的复制，脊椎动物宿主进化出了防御策略，将金属从入侵的病原体中隔离出来7，称为营养免疫。其中营养金属是被宿主蛋白如钙保护蛋白（CP）、脂钙素-2、乳铁蛋白等所螯合8。然而目前尚不清楚艰难梭菌如何适应这些蛋白介导的铁限制，以及这种病原体如何在感染期间抵抗营养免疫。

2023年11月15日，范德堡大学Eric Skaar教授团队在Nature上发表了题为Clostridioides difficile ferrosome organelles combat nutritional immunity的研究性论文。该研究发现艰难梭菌通过产生含有无定形磷酸铁生物矿物质的铁质体细胞器来储存铁，并通常定位在细胞膜附近。膜蛋白FezA与P1B6-ATP酶转运体(FezB)是铁质体形成过程所必需的，并在铁稳态中发挥重要作用。通过使用两种艰难梭菌感染的小鼠模型，作者证明了铁质体会在发炎的肠道中被激活，以对抗由钙保护蛋白所介导的宿主营养免疫，并且该过程对艰难梭菌的定植和生存至关重要。

由于艰难梭菌的铁稳态系统仍未知，作者将铁剥夺过程中表达上调最多的基因命名为FezA（编码膜蛋白）与FezB（编码P1B6-ATP酶转运体），并在启动子区鉴定到了两个Fur box以及一个 87 bp的基因（fezX）（图1a）。qPCR结果表明所有三个基因的转录在Fur活性缺失的突变体（Fur::CT）中都被去阻遏（图1b），并且在铁螯合剂双吡啶介导的铁限制下被强烈诱导(图1c)。由于FezB是三种革兰氏阴性厌氧菌形成铁质体所必需的，作者进一步地通过构建FezB缺失突变体（ΔfezB）来研究其在艰难梭菌中的生理功能。将过量的FeSO4添加到缺铁细胞后，ΔfezB表现出延长的滞后期，表明FezB在从铁稀缺向铁过量转变的过程中发挥了关键作用（图 1d-e）。通过电感耦合等离子体质谱(ICP-MS) 监测细胞内金属离子水平也证明了这一结论（图 1f）。

图1. FezB受Fur和铁的调控，并在维持铁稳态中起关键作用

先前的研究表明三种革兰氏阴性厌氧菌以依赖FezB的方式产生电子致密铁颗粒（铁质体）3，为此作者推测FezB是艰难梭菌形成铁质体所必需的。为了验证这一点，作者使用扫描透射电子显微镜（STEM）以及高角度环形暗场（HAADF）探测器可视化铁质体。向缺铁细胞中添加铁后，能够在艰难梭菌WT细胞中检测到铁质体存在，而ΔfezB中只能看到无序的铁沉淀（图 2a-c）。并且fur::CT突变体可以观察到组成性表达的铁质体（图 2d），而在fur::CT背景中敲除FezB可以消除颗粒形成（图 2e）。定量结果也证实了上述的结论（图 2f），FezB是艰难梭菌形成铁质体所必需的。

图2. FezB是艰难梭菌胞内生物矿化所必需的

接下来作者使用能谱分析（EDS）确定铁质体的元素组成，结果表明铁、氧、磷信号与铁质体共定位（图3a-e），但钙信号在细胞中均匀分布（图3f）。为了观察艰难梭菌中的铁质体存在于细胞表面、细胞膜还是细胞质中，作者使用电子断层扫描以及三维重建发现大多数铁质体位于细胞质中（图3g-i）。为了进一步地确定铁质体的定位以及化学组成，作者对fur::CT细胞系进行冷冻替代。STEM结果表明铁质体定位于细胞质并且EDS分析表明铁小体仅含铁、氧和磷元素（图3j-o）。综合这些微观结构分析表明艰难梭菌产生的铁质体含有无定形磷酸铁生矿物质。

图3. STEM-EDS测定艰难梭菌产生的细内电子致密颗粒的化学成分

作者使用冷冻电子断层扫描（cryo-ET）进一步发现在细胞膜附近能够观察到铁质体簇，并且簇内存在脂质样膜囊泡（图4a-d）。并且将铁质体分离后进行冷冻电镜成像，所有成像的铁质体都被脂质样膜包裹，内部填充了不同含量的铁磷酸盐矿物质（图4e-f）。为了更好地原位观察铁质体膜结构，作者使用冷冻聚焦离子束扫描电镜（cryo-FIB-SEM）以及 cryo-ET成像，结果表明铁质体具有膜包裹的囊泡结构，且铁质体簇通常位于细胞膜的相邻区域（图 4g-n）。

图4. 通过Cryo-ET揭示的铁质体的囊泡结构

为了研究铁质体对CDI的贡献，作者用WT或ΔfezB感染C57BL/6小鼠，并在感染后4天监测疾病进展。与感染WT的小鼠相比，感染ΔfezB的小鼠在第四天时表现出更少的细菌负担和体重减轻（图5a）。炎症性肠病（IBD）与艰难梭菌相关，部分可能是由于IBD患者胃肠道中的铁水平被破坏9。为了评估IBD和CDI对肠道中金属水平的影响，作者使用ICP-MS对四组人类患者的粪便样本进行了金属定量分析，与其他三组相比，CDI患者的铁水平明显降低（图5b）。在葡聚糖硫酸钠（DSS）诱导的结肠炎小鼠模型中，WT艰难梭菌感染降低了铁水平（图5c）。因此作者认为铁质体对艰难梭菌在炎症肠道中适应铁应激很重要。用WT或ΔfezB感染DSS处理小鼠后，ΔfezB感染相比于 WT感染细菌定植、结肠缩短、炎症、粘膜下水肿以及 CP均显著减轻（图5d-l）。接下来，作者利用qPCR技术评估CP对fezXAB转录的影响。与体外对照相比，CP处理后fezXAB的表达上调（图5m），而在 CP缺陷小鼠中，三种基因的激活明显减弱（图5n），表明CP介导的铁封存是CDI期间铁质体激活的主要因素。并且用WT或ΔfezB感染CP缺陷小鼠时，两组之间并没有观察到差异（图5o）。

图5.艰难梭菌铁质体对抗宿主营养免疫

综上所述，该研究表明fezXAB对于艰难梭菌铁质体细胞器的形成是充分必要的，铁质体作为铁储存机制能够有效缓解铁过载和氧化应激。在CDI过程中，铁质体在体内被激活从而对抗宿主营养免疫，并且对于艰难梭菌以CP依赖的定植十分重要。这一发现不仅表明了铁质体在艰难梭菌铁代谢过程的重要作用，同时也为开发治疗厌氧菌感染的抗菌药物提供了新靶点。

转自：“水木未来资讯”微信公众号

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