空气污染物对人体健康的损害是多方面的，现有研究认为除了损害呼吸、循环系统之外，空气污染物如 PM2.5 还会对眼部组织造成损害，导致结膜炎、干眼症等疾病。视网膜是人眼形成视觉的重要组织结构，由于视网膜能量代谢率高、血流丰富，易受到来自血液的各种有害物质的损害，考虑到视网膜并非直接接触空气，空气污染物能否损害视网膜存在争议，有研究认为，接触 PM2.5 会导致视网膜组织改变，进而发生年龄相关性黄斑变性（AMD）, 但其致病机制一直并未充分阐明。
近日，浙江大学医学院附属第二医院眼科中心、浙江大学眼科医院姚克教授、傅秋黎副研究员团队与浙江省疾病预防控制中心王晓峰、浙江大学李鹏副教授团队合作在 Particle and Fibre Toxicology 上发表了一篇名为 Acute and continuous exposure of airborne fine particulate matter (PM2.5): diverse outer blood–retinal barrier damages and disease susceptibilities 的研究。该研究通过建立动物模型，在表型水平对该问题进行了研究。据研究者称，这是首次确立和描述空气污染暴露对眼部「外血—视网膜屏障」（oBRB）损害机制的研究，解释了污染物诱发 AMD 的患病机制。
该研究是在前期研究基础上展开的，研究者在此前进行过 PM2.5 对「内血—视网膜屏障」（iBRB）损害的动物实验研究，发现 PM2.5 对 iBRB 造成损害，这是糖尿病视网膜病变等常见视网膜疾病的病理基础。本次研究建立的动物模型与前期研究一致，即对小鼠用 1 毫克/毫升的 PM2.5 悬浮液滴眼，观察其急性（3 天）、慢性（3 周）的「外血—视网膜屏障」（oBRB）损害机制。由于 oBRB 由视网膜色素上皮（RPE）单层细胞和邻近的布鲁赫膜组成，位于视网膜和脉络膜之间，该研究主要围绕 PM2.5 对 PRE、脉络膜的损害机制展开。
研究揭示了急性 PM2.5 暴露对 RPE 屏障功能的影响：光学相干断层扫描（OCT）发现暴露组 RPE 上方的视网膜出现明显水肿，视网膜水合率测定也显示暴露组水肿率远高于 PBS 对照组。为揭示水肿的原因，研究进一步对 RPE 细胞铺片进行 RPE-65 免疫荧光检测，发现 RPE 细胞的细胞间隙扩大、连接结构消失。经免疫印迹和免疫荧光检测，暴露组某些区域的连接蛋白含量出现明显变化，维持屏障结构的 PRE 细胞之间的两种 TJ 连接蛋白：Occludin 和 ZO1 受到影响。这些发现可以证实在急性 PM2.5 暴露条件下，RPE 的完整性受到破坏，其屏障功能受损并导致视网膜水肿。（见图 1、2）
图 1（
来源：Particle and Fibre Toxicology）
图 2（
来源：Particle and Fibre Toxicology）
研究揭示了急性 PM2.5 暴露对脉络膜血管的影响：眼部 HE 染色结果发现脉络膜出现明显增厚，而 PRE 厚度明显减低。经对脉络膜进行光学相干性断层扫描血管造影（OCTA），与暴露前相比较，脉络膜部分血管明显扩张，脉络膜血流明显增加。通过免疫印迹检测 RPE 和脉络膜组织中的 IL1B、IL6、TNF-α 等炎症相关因子，发现脉络膜血管的炎症明显高于 PBS 对照组。由于脉络膜与 PRE 的结构及功能密切相关，这些发现可以证实，在 PRE 出现改变的同时，脉络膜血管发生了扩张并伴有炎症发生。（见图 3）
图 3（
来源：Particle and Fibre Toxicology）
研究揭示了慢性 PM2.5 暴露导致的 AMD 相关视网膜病理变化：通过免疫印迹检测 RPE 和脉络膜组织中的 IL1B、IL6、TNF-α 等炎症相关因子，发现脉络膜血管的炎症仍然高于 PBS 对照组。对 RPE 细胞铺片进行 RPE-65 免疫荧光检测，RPE 细胞间的连接结构基本得到修复。ZO1 的免疫荧光检测及 Occludin 的免疫印迹检测结果显示这两种 TJ 连接蛋白均得到恢复。水合率检测显示，暴露组的水肿也趋于改善。但是，OCTA 发现视网膜毛细血管密度明显高于暴露前，电镜还发现布鲁赫膜明显增厚。这些发现可以证实，虽然受损结构得到一定程度的修复，但持续 PM2.5 暴露促进了视网膜毛细血管增殖化及布鲁赫膜增厚，这些都是 AMD 的特征性病理改变，持续 PM2.5 暴露与 AMD 相关。（见图 4、5）
图 4（
来源：Particle and Fibre Toxicology）
图 5（
来源：Particle and Fibre Toxicology）
研究揭示了短期扩张的脉络膜血管导致 PRE 毒性及 TJ 损害：由于上述研究发现急性 PM2.5 暴露导致脉络膜血管扩张，故其内皮发生了拉伸，为揭示具体的致病机制，研究者模拟了该血管扩张的病理条件。研究者将拉伸状态的人类脐静脉内皮细胞（HUVECs）与 PRE 细胞（ARPE-19）进行了间接共培养。在 24 小时短期培养情况：在拉伸状态 HUVECs 条件下，PRE 细胞未能实现完整的生长状态，且经细胞旁渗透性分析，其产生更多的荧光黄泄漏，BrdU+细胞的百分比下降，表明细胞的屏障功能、增殖程度均下降，且经划痕实验证实，细胞愈合速度也出现减慢。免疫印迹及免疫荧光检测 ZO1 和 Occludin 蛋白的含量下降，在细胞膜分布减少。这些发现可以证实急性 PM2.5 暴露引发脉络膜血管扩张会导致 PRE 及 TJ 受损。（图 6）
图 6（
来源：Particle and Fibre Toxicology）
研究揭示了长期扩张的脉络膜血管对 RPE 损害产生适应及修复：在 48 小时的长期培养情况下，CCK-8 检测显示，RPE 细胞的生存能力与对照组（未拉伸的 HUVECs 影响）相比无显著差异，BrdU+细胞百分比增加，表明细胞增殖水平补偿性的增加，而 TJ 蛋白（ZO1 和 Occludin）与对照组相比没有显著差异。这些发现可以证实 PRE 细胞适应了损害并产生了修复效应。（图 7）
图 7（
来源：Particle and Fibre Toxicology）
研究认为，AMD 与中心性浆液性脉络膜视网膜病变（CSC）相似，都是所谓「肥厚性脉络膜病」的一种，其共同病理机制均为脉络膜肥大、血管扩张和 RPE 功能受损。不同于 CSC 被认为与吸烟有关，AMD 更被认为与空气污染物 PM2.5 暴露密切相关。该研究区分短期和长期两种暴露方式，通过动物模型和细胞共培养模型，证实了 PM2.5 暴露对 RPE 和脉络膜的影响，为确定空气污染与 AMD 的关联提供了证据。
此外，本次研究改进了实验方式，不同于以往研究将 RPE 浸泡于 PM2.5 悬浮液的直接接触方法，本次研究改用 PM2.5 悬浮液滴眼，在保留眼屏障的基础上，模拟了生物体内微环境，更符合污染物的真实作用方式。而且，为研究血管扩张的影响，研究者还开创性的利用拉伸 HUVECs 模拟了血管扩张的条件，通过共培养探索了 RPE 的改变机制，为进一步研究其分子机制铺垫了实验基础。
转自：“丁香学术”微信公众号
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