导读
线粒体自噬 (mitophagy) 是重要的线粒体质量及数量调控机制, 与发育、癌症、衰老和神经退行性病变等生理病理状况高度相关。现已知两类哺乳动物 mitophagy 通路：由 PINK1-Parkin 介导的泛素依赖途径，以及由 BNIP3, NIX 和 FUNDC1 等介导的受体依赖途径。然而，人们对 mitophagy 调控机制及其生理病理意义仍有待探索。突出的表现是，缺失已知 mitophagy 通路的小鼠 (如 Pink1-/-、Parkin-/-、Bnip3-/-等) 表型微弱，与普遍认知的 mitophagy 重要性有明显差距。
2023 年 12 月 26 日，北京生命科学研究所/清华大学生物医学交叉研究院蒋辉实验室在 Molecular Cell 在线发表了题为 A mitophagy sensor PPTC7 controls BNIP3 and NIX degradation to regulate mitochondrial mass 的论文。该论文发现了一个感知并抑制 mitophagy 的因子 PPTC7，阐明了 PPTC7 调控 mitophagy 的分子机制并揭示其对线粒体数量和代谢稳态的调控作用。作为监控 mitophagy 水平的关键因子，PPTC7 感知 mitophagy 受体 BNIP3 和 NIX 的蛋白水平，进而起始 BNIP3/NIX-PPTC7-SCFFBXL4 完整复合物的组装，促进 SCFFBXL4 泛素化和降解 BNIP3 和 NIX，从而抑制 mitophagy。该通路对维持细胞线粒体数量、代谢平衡、和个体存活至关重要。
FBXL4 介导的 mitophagy 调控与退行性疾病 MTDPS13
蒋辉实验室长期从事线粒体蛋白稳态调控机制研究，之前报道了一个线粒体外膜复合物 UBXD8-VCP 介导 BNIP3 降解，从而抑制 mitophagy。为进一步发掘 mitophagy 调控机制，研究生曹钰通过靶向线粒体的遗传筛选发现多个 mitophagy 抑制因子，其中包括 FBXL4 和 PPTC7。已知 FBXL4 突变导致致死性退行性疾病线粒体 DNA 耗竭综合征 13(MTDPS13)1,2，但其机理未明。作者发现 FBXL4 定位于线粒体外膜，与 Skp1 和 Cullin1 组成 SCFFBXL4 E3 泛素连接酶。SCFFBXL4 通过泛素化降解 BNIP3 和 NIX 来抑制 mitophagy。而病人来源的 FBXL4 突变抑制 SCFFBXL4 组装，导致 BNIP3 和 NIX 蛋白积累和 mitophagy 过度激活。FBXL4 突变患者表现出 mtDNA 耗竭、线粒体数量减少、酸中毒、神经和肌肉退行性病变等严重症状。与 FBXL4 突变病人类似，Fbxl4-/- 小鼠表现出 BNIP3 和 NIX 蛋白积累、mitophagy 失控、线粒体数量减少、代谢紊乱和围产期死亡等严重表型。更重要的是，在 Fbxl4-/- 小鼠中敲除 Bnip3 或 Nix 可以挽救线粒体数量、恢复代谢平衡并挽救小鼠寿命。这些结果表明过度 mitophagy 导致的线粒体数量减少是 MTDPS13 的致病原因并为治疗提供了思路。
PPTC7 调控 FBXL4 介导的 BNIP3 和 NIX 降解
鉴于 BNIP3 和 NIX 强大且危险的线粒体清除能力，细胞必须牢牢控制其水平，但细胞监控并调节 BNIP3 和 NIX 降解的分子机制仍不清楚。研究生孙雨秋研究另一个筛选发现的 mitophagy 抑制因子 PPTC7。前人研究表明 PPTC7 是定位于线粒体基质的磷酸酶。但令人诧异的是，与敲除 FBXL4 类似，敲除 PPTC7 同样导致 BNIP3 和 NIX 的积累和过度 mitophagy；Pptc7-/- 小鼠表现出 mitophagy 失控、线粒体数量减少和围产期死亡的表型，且该表型可以被 Nix 敲除所挽救 (图 1)。此外，PPTC7 过表达可促进内源 BNIP3 和 NIX 被 FBXL4 降解，而 FBXL4 过表达则没有效果，提示 PPTC7 作为上游限速因子调控 FBXL4 介导的 BNIP3 和 NIX 降解。但是，线粒体基质蛋白 PPTC7 如何调控线粒体外膜上的蛋白降解？
图 1 PPTC7 缺失过度激活 BNIP3 和 NIX 依赖的 mitophagy，造成线粒体数量减少和小鼠死亡。
B, 小鼠生存曲线。
PPTC7 前体通过与 BNIP3/NIX 直接互作，滞留在线粒体外膜
通常情况下，线粒体基质蛋白的前体形式 (precursor) 在 N 端定位序列 (targeting sequence) 的引导下进入线粒体，并在线粒体基质切除定位序列，完成成熟过程。作者发现在野生型细胞里，PPTC7 以成熟形式 (mature form, 切除了定位序列) 存在于线粒体基质，而在 FBXL4-KO 细胞里，PPTC7 同时具有定位于线粒体基质的成熟形式和定位于线粒体外膜的前体形式。进一步分析表明，FBXL4-KO 细胞中积累的 BNIP3 和 NIX 导致 PPTC7 前体出现在线粒体外膜; 在野生型细胞中直接过表达 BNIP3 或 NIX 也可诱导 PPTC7 前体出现在线粒体外膜定位。
通过体外重组蛋白实验，作者发现 BNIP3 和 NIX 与 PPTC7 直接互作，并使用交联质谱分析了 NIX-PPTC7 的互作区域。在截去 NIX 与 PPTC7 的直接互作区域后，NIX 无法诱导 PPTC7 前体的外膜定位，表明 BNIP3 和 NIX 通过与 PPTC7 的直接互作，将 PPTC7 前体定位于线粒体外膜。
弱化的 PPTC7 定位序列帮助 PPTC7 在线粒体外膜滞留
有意思的是，作者发现与经典线粒体基质定位序列相比，PPTC7 的定位序列长度短且引导能力差，推测该特征削弱了 PPTC7 前体进入线粒体基质的能力，有利于 PPTC7 前体被外膜 BNIP3/NIX 滞留。因此，研究者将 PPTC7 的定位序列替换成经典序列，发现它使 PPTC7 全部进入线粒体基质，无法被滞留在外膜，失去调节 BNIP3 和 NIX 降解的能力。
外膜 PPTC7 起始组装 BNIP3/NIX-PPTC7-SCFFBXL4 复合物
那么外膜 PPTC7 如何促进 SCFFBXL4 介导的 BNIP3 和 NIX 降解呢？作者发现除与 BNIP3/NIX 直接互作之外，PPTC7 还与 SCFFBXL4 复合物中的 Cullin1 直接互作。作者表达纯化了 NIX，PPTC7，FBXL4,Cullin1-Rbx1 和 Skp1 的重组蛋白，发现只有在所有蛋白都存在的情况下，这些蛋白才能组装成完整的 NIX-PPTC7-SCFFBXL4 复合物，缺少 NIX，PPTC7，FBXL4 任何一个组分都导致复合物散架。
以上结果提供了一个 mitophagy 的负反馈调控模型: 积累在线粒体外膜的 mitophagy 受体 BNIP3 和 NIX 与 PPTC7 前体直接互作，将其滞留在外膜，起始 BNIP3/NIX-PPTC7-SCFFBXL4 复合物的组装，从而泛素化和降解 BNIP3 和 NIX，防止 mitophagy 过度激活 (图 2)。
禁食情况下，肝脏诱导 PPTC7 来抑制 mitophagy 和维持代谢稳态
一个重要的问题是在负反馈调控 mitophagy 之外，PPTC7 是否还会响应生理信号？鉴于 PPTC7 过表达能促进 BNIP3 和 NIX 降解，作者重点研究了生理信号对 PPTC7 表达的调节，发现禁食不改变骨骼肌 PPTC7 的表达，但在肝脏强烈诱导 PPTC7。与之相对应，禁食强烈诱导骨骼肌 mitophagy，但不改变肝脏 mitophagy 水平，作者推测肝脏 mitophagy 受到 PPTC7 上调的压制。
因此，作者在小鼠肝脏敲除 PPTC7，发现禁食导致缺失 PPTC7 的肝脏丢失大量线粒体。禁食情况下，肝脏负有重要使命-通过糖异生 (gluconeogenesis) 维持血糖水平。而糖异生需要线粒体提供两个重要支持：ATP 和丙酮酸羧化酶 (pyruvate carboxylase)。作者发现，敲除肝脏 PPTC7 导致禁食状态下肝脏 ATP 缺乏，糖异生受阻，造成严重的低血糖。因此，禁食情况下，肝脏特异上调 PPTC7 以压制 mitophagy，从而维持线粒体数量和代谢稳态 (图 2)。
图 2 PPTC7 调控 mitophagy 的工作模型。
1. mitophagy 的负反馈稳态调控。正常情况下，PPTC7 表达后进入线粒体基质行使正常功能。当 mitophagy 受体 BNIP3 和 NIX 积累时，BNIP3/NIX 将 PPTC7 前体滞留于外膜，起始 BNIP3/NIX-PPTC7-SCFFBXL4 复合物组装，从而降解 BNIP3 和 NIX，防止 mitophagy 过度激活和线粒体丢失。
2. 在禁食情况下，肝脏上调 PPTC7 以压制 mitophagy，从而维持肝脏能量供应和糖异生通路活力，维持血糖水平。
综上，该工作报道了一个感知和抑制 mitophagy 的 PPTC7-SCFFBXL4 通路。PPTC7 作为关键调控因子，能够整合稳态维持和生理信号来调控 mitophagy 水平，以此维持线粒体数量和细胞代谢稳态。该通路的发现显著增进了我们对 mitophagy 与线粒体数量控制 (mitochondrial mass control) 的理解。禁食情况下，肝脏和骨骼肌对 mitophagy 的差异化调节及其功能研究也丰富了我们对生理情况下组织特异性 mitophagy 调控的认知。
清华大学生物医学交叉研究院博士生孙雨秋为论文第一作者，蒋辉博士为通讯作者。该论文其他作者包括蒋辉课题组的曹钰和万华云，董梦秋实验室的阿达莱提买买提明和董梦秋博士，代谢组学中心的马燕博士和曹杨，蛋白质组中心的陈涉博士和李琳，遗传筛选中心的李祺博士和吴重阳，刘清华实验室的王濛。该研究由科技部、北京市政府和清华大学共同资助，在北京生命科学研究所完成。
转自：“丁香学术”微信公众号
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