所有生命形式，从微生物到多细胞生物，面临外界环境变化及突发危险时，都能迅速产生一系列相互关联的应激反应来适应环境。特别是植物，由于无法自主移动，它们在遗传学、表观遗传学、细胞学、分子生物学和生化学等方面发展了对环境压力（如热、干旱和高盐度）的精细应对策略。这些策略包括利用细胞表面的复杂信号网络来适应环境变化，这个过程在细胞水平上充满了神秘和挑战。近年来，拟南芥中的FERONIA（FER）和LORELEI-LIKE GPI-anchored protein 1（LLG1）共受体被发现是控制生长和生存的众多细胞和分子反应的关键调节器。这些受体在植物生长发育的多个阶段发挥作用，尤其是在应对外界环境压力时显得尤为重要。它们与一种名为快速碱化因子（RALF）的小分子肽进行相互作用，共同参与调节植物的生理反应。
此外，植物细胞壁与细胞膜保持紧密联系，并影响其生物活动。果胶作为细胞壁中的主要多糖，在植物的生长和生存中发挥不可或缺的作用。FER的胞外域（FERecd）与果胶结合，影响细胞壁质量和FER控制的生物过程。FERecd和RALF还与富含亮氨酸重复的外骨骼互动，这些与细胞壁紧密结合，并参与生长调节。FER还与细胞壁重塑和木质素相关的防御过程交叉，其中木质素是次生细胞壁中的重要聚合物。
液-液相分离（LLPS）作为控制多种生物过程的主要机制正日益受到关注，这些过程发生在核或细胞质中，RALF是一种在植物体内广泛存在的小分子肽，而果胶以其同半乳糖醛酸或聚半乳糖醛酸（PGA）主链为特点，具有响应环境中变化条件的相转变能力。近日美国马萨诸塞大学生物化学和分子生物学系Alice Y. Cheung课题组在CELL期刊上发表了题为：“Extracellular pectin-RALF phase separation mediates FERONIA global signaling function”的文章。研究报告称，RALF和果胶片段在细胞壁-细胞膜界面相分离，形成RALF-果胶凝聚物，以介导FER-LLG1的信号传导作用。研究还展示了RALF诱导FER和LLG1的聚集和内吞，并以FER和LLG1依赖的方式普遍诱导广泛的非相应受体聚集和内吞，符合FER-LLG1所扮演的广泛生物角色。此外，RALF-果胶相分离对高盐和升高温度做出反应，提供一种细胞外感应机制，触发普遍的FER和LLG1依赖的细胞表面反应，并激活一种应对策略，以确保在环境压力下的抗性。
作者首先研究了RALF对其主要受体FER和LLG1的影响，发现重组和合成的RALF1、RALF23通过与FER和LLG1结合，诱导了这些受体的内吞作用。特别是，RALF1的YISY区域对于激发受体的内吞至关重要。然而，一些RALF1的N端突变体未能触发这种内吞作用，显示出配体-受体相互作用的特异性。此外，RALF1诱导了拟南芥H+ -ATP酶AHA2的内吞作用，这可能是其影响细胞生长的机制之一。同时还观察到，RALF1和RALF23能诱导多种细胞表面调节器的内吞，以及增加内吞标记染料FM4-64的摄取。这些发现表明，RALF诱导的内吞作用广泛并具有选择性。RALF1在诱导FER和LLG1的内吞作用时，本身并未被带入细胞内。这可能与RALF1与细胞壁的相互作用有关，防止了其被内吞。总体而言，这些结果揭示了一种RALF触发的、依赖FER-LLG1的细胞表面机制，它通过同时影响多个功能途径，实现了FER-LLG1的多方面生物学作用。
图1. RALF诱导的内吞作用，其本身仍保留在细胞外
进一步对RALF如何通过触发FER和LLG1的聚集，来引导广泛的细胞膜受体内吞作用进行研究。使用野生型和突变体RALF1对拟南芥幼苗根细胞进行成像，发现RALF1刺激FER-GFP和LLG1-GFP在细胞膜中聚集，并促进其内吞。通过总内反射荧光显微镜（TIRFm）对这一过程进行可视化。进一步的研究显示，RALF1还能在烟草叶表皮细胞中诱导FER和LLG1的共聚集，形成三元RALF-FER-LLG1复合体。此外，RALF1也能诱导其他非相应靶标受体如Brassinosteroid Insensitive 1（BRI1）和Flagellin-sensitive 2（FLS2）的聚集。这种聚集不仅局限于与其相应配体的相互作用，也涉及其他信号通路的交叉。在fer-4和llg1-2突变体中，这种RALF1诱导的共聚集现象明显减弱，表明它依赖于FER和LLG1的相互作用。RALF不仅增强了FER-LLG1信号的激活，也可能影响非相应受体如BRI1和FLS2的信号。这一机制与通常仅针对相应受体的配体（例如flg22和BR）形成鲜明对比，暗示了FER-LLG1可能是为了承担多种功能角色而进化出来的。此外，这一机制可能为RALF23负向调节FLS2信号提供了一个新的解释途径。
图2. RALF诱导同源和非同源细胞表面受体聚集
RALF与果胶相互作用促进了体外和植物体内果胶-RALF-FER-LLG1凝聚物的组装。研究显示，RALF1与不同大小的去酯化果胶（如OGDP10–15和OGDP25–50）发生相互作用。虽然RALF1和果胶单独在体外不形成相分离凝聚物，但它们结合时可以形成易于检测的聚集物。这些RALF-果胶聚集物的形成取决于RALF1和果胶的浓度，且受RALF1的N端YSIY基序影响。
研究进一步观察了RALF、果胶、FER和LLG1的共同相互作用。结果表明，FER和LLG1能与RALF1和不同大小的果胶片段组装成包含所有四种组分的颗粒。这些组装过程显示了RALF-果胶复合体作为颗粒形成的成核点。这种果胶-RALF自组装过程与果胶-RALF-FER-LLG1颗粒的形成，展现了一个自发的、类似于液-液相分离（LLPS）的混合过程，这通常是高度动态的。光漂白后荧光恢复（FRAP）实验显示了果胶-RALF1和果胶-RALF1-FERecd凝聚物的快速荧光恢复，进一步证实了这些凝聚物的形成是一个类似于LLPS的动态过程。这一发现为理解RALF如何在植物体内与果胶和受体互作，从而影响细胞外环境，提供了新的视角。
图3. 果胶-RALF相分离和果胶-RALF-FER-LLG1缩合物在体外和体内的组装
对RALF1-果胶相分离在触发生物学反应中的作用研究发现RALF1与果胶的相分离可增强体内生物过程，例如通过激活FER依赖的细胞内[Ca2+]尖峰。此外，RALF1与果胶的相互作用被证实是紧密相关的，化学破坏果胶环境会消除RALF1诱导的反应。进一步研究表明，RALF和果胶在细胞表面发生相分离，形成RALF-果胶凝聚物，并与RALF触发的受体聚集有关。为了探究这一现象的生物学意义，研究者生成了RALF1突变体，并考察了这些突变对RALF1-果胶相分离和RALF1触发的反应的影响。结果显示，与野生型RALF1相比，这些突变体在形成肽-果胶凝聚物方面受损，产生的颗粒数量和大小明显减少。这些观察结果强调了特定残基，如精氨酸和酪氨酸，对于RALF1与果胶相互作用的重要性。通过荧光各向异性分析，将RALF1突变体分为两组，进一步确认了这些突变对RALF1-果胶相互作用的影响。此外，这些突变体在诱导FER和LLG1内吞作用及抑制根生长方面的能力也受到明显影响。这些发现支持了RALF1-果胶凝聚物在激发多种生物学过程中起到关键作用的观点，特别是在成核多价相互作用方面。
图4. RALF1s 突变体分析
作者通过一系列实验验证了不同果胶状态在RALF触发的受体聚集和内吞作用中的关键作用。果胶作为植物细胞壁中最动态的组成部分，其状态受到果胶修饰和降解剂的调节。实验表明，改变果胶状态，如通过EGCG抑制剂扰乱或过表达PMEI5改变果胶去酯化水平，会影响RALF1诱导的FER-GFP聚集和内吞作用。进一步研究发现，通过暂时表达ADPG1增加细胞壁中果胶片段的水平，可以显著增加Cy3-RALF1表面簇的数量。这表明去酯化和碎片化的果胶在增强果胶-RALF凝聚上起重要作用。此外，使用壳聚糖装饰实验验证了这些Cy3-RALF1凝聚物实际上是由增加的果胶片段产生的。为了进一步探究去酯化果胶片段在RALF诱导的受体聚集和内吞中的作用，实验共表达了FER-GFP与PMEI5或OGOX1。结果显示，这两种条件都抑制了RALF诱导的FER-GFP聚集和内吞作用。然而，预处理OGDP10–15可抵消PMEI5和OGOX1的抑制效果，恢复受体聚集和内吞作用。这些结果共同证明了生物活性去酯化果胶片段在RALF触发的受体聚集及其随后的内吞作用中扮演至关重要的角色，这一发现加深了对果胶-RALF相分离及其在细胞表面同源和非同源受体聚集中的作用的理解。
图5. 果胶和RALF协调控制植物中RALF触发的FER和LLG1依赖性反应
作者对果胶-RALF-FER-LLG1相互作用对植物抵抗压力的生物学意义进行了深入研究，发现RALF和果胶影响FER到ROS（活性氧物质）的途径，对FER-LLG1控制的信号途径至关重要。实验显示，突变体幼苗（如fer-4和llg1-2）和幼苗中RALF1水平降低或果胶去酯化抑制时，ROS水平显著降低。RALF1和OGDP10–15在正常条件下刺激了ROS水平，这一过程依赖于FER、LLG1和未受干扰的果胶条件。研究还探索了果胶-RALF-FER-LLG1介导的大量内吞作用是否为植物应对环境压力（如高盐和升高温度）的机制。结果显示，这些压力诱导了FER、LLG1、BRI1和FLS2等细胞表面调节器的内吞作用。在正常条件下，WT拟南芥幼苗的内吞作用显著增加，而在fer-4和llg1-2突变体或果胶状态受扰的幼苗中内吞作用受损，证明了这种内吞作用与压力反应的联系。进一步实验表明，WT植物在适应高盐环境后能够恢复生长，而fer-4的生长仍受阻。这表明大量内吞作用是生存中的应对压力策略。化学或遗传上抑制内吞作用降低了幼苗从压力中恢复的能力，强调了果胶-RALF-FER-LLG1组合对植物应对环境压力的重要性。总的来说，这些结果揭示了果胶-RALF-FER-LLG1在确保植物对盐和热压力的韧性方面发挥了协同和关键作用，特别是通过促进大量内吞作用。
图6. 果胶-RALF相互作用触发FER-LLG1信号并诱导大量内吞作用作为应激应对策略
压力如何在细胞表面触发果胶-RALF相分离，并介导相应和非相应靶标的聚集，作者对压力诱导的大量内吞作用的前奏进行研究。实验发现，高盐和升高温度诱导了RALF1-GFP在RALF1启动子转化幼苗中的聚集。这些压力反应依赖于FER和适当维持的去酯化果胶环境，增加了RALF聚集。研究表明，这些压力反应中增加的RALFs和果胶片段是参与压力诱导的聚集的关键因素。盐压力诱导的内源性RALF1-GFP聚集表现为高度动态，与液-液相分离（LLPS）过程一致。此外，高盐和温度也触发了拟南芥幼苗中多个受体的聚集，例如FER-GFP、GFP-LLG1、BRI1-GFP和FLS2-GFP。这些聚集反应涉及内源性果胶片段的整合。研究还发现，非生物和生物压力，如高盐、升高温度，会影响细胞壁重塑相关基因的表达，包括ADPGs、RALF1和S1P。这些压力条件创造了改变的胞间隙条件，提高了RALF和去酯化果胶的水平。这些改变的胞间隙条件增强了果胶-RALF凝聚和FER、LLG1及其他膜靶标的聚集。这些事件作为对压力信号的快速反应，激活多条信号途径，并通过随后的大量内吞作用调节激活过程，介导新的细胞稳态，以确保更持久的生存反应。总体来看，这些发现支持高盐和温度通过改变胞间隙条件，增强果胶-RALF凝聚和膜靶标聚集的观点，并揭示了非生物压力增加胞间隙RALFs可能降低免疫信号的机制，为将非生物压力与免疫反应整合提供了新的视角。
图7. 盐和热胁迫促进RALF-果胶相分离和非选择性受体聚集
本研究发现了一种细胞表面机制，其中果胶-RALF相分离在介导细胞表面调节器的聚集和内吞作用中发挥关键作用。这一机制是FER表现其多样生物学角色的基础，包括在细胞壁-细胞膜界面发生的果胶-RALF相分离。这种相分离过程不同于迄今为止研究的许多生物系统中的相分离，因为它涉及细胞壁糖聚合物和一种分泌的无序肽，即作为受体模块的配体的RALF。果胶和RALF的相互作用对于核心FER到ROS信号途径的活性至关重要。当在细胞中应用RALF时，这一相分离现象在低水平上显著，而提高细胞壁中去酯化果胶水平或通过压力改变胞间隙环境可以增强相分离现象。这些观察结果支持RALF-果胶协作影响细胞壁性质和细胞膜中受体组织的观点。在生物学和机械学方面的实验表明，果胶-RALF相分离在细胞壁-细胞膜界面在生物学上显著。这种相分离过程是通过特异性和多价相互作用来成核分子组装，并支持其扩散成为多样生物分子的显著分子凝聚物。这些发现表明，果胶-RALF片段凝聚物可能作为组装生物活性外骨骼的支架，支持FER-LLG1信号模块的多任务能力。此外，由内源性需求或外源性刺激触发的生物学后果通常是多个相互补偿和协调活动的总和。这些发现表明了一种分子创新，能够在响应任何单一信号的同时广泛参与不同的细胞过程。相分离介导的混杂反应能够快速和协调地激活多个独立控制的信号通路，为植物提供了一个短暂但关键的时间窗口，以协调更持久的下游响应，应对环境的挑战。这种机制可能在植物物种中广泛存在，成为协调中的共同主题。
同时作者提出本研究在探索果胶-RALF凝聚物的结构和物理化学基础方面存在局限性，尤其是理解果胶如何与RALF和FER在体外和植物细胞表面更高分辨率地相互作用。生物学上的挑战包括明确果胶-RALF凝聚物如何参与细胞壁-细胞膜界面中多种分子的多价相互作用，并招募它们到活跃的信号复合体中。另一个关键问题是如何阐明胞间隙RALFs的波动对细胞壁合成和重塑的影响，这将有助于更精确地理解RALF-FER信号如何影响与生长和生存密切相关的细胞壁。此外，果胶-RALF-FER-LLG1介导的细胞表面反应如何转化为各个途径上的下游后果，以及对细胞质和核反应的整体情况，也需要进行更详细的研究。
原文链接：
https://doi.org/10.1016/j.cell.2023.11.038
转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号
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