消息来源：iNature
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拷贝数变异，特别是基因组区域的重复，与包括自闭症谱系障碍(ASD)在内的各种神经退行性疾病密切相关。研究发现，这些基因变异对大脑发育和功能有重大影响，可能导致神经和行为症状的出现。开发针对这些基因组复制的策略具有挑战性，因为重复基因的内源性拷贝的存在往往使编辑策略复杂化。
2023年11月14日，博德研究所张锋及麻省理工学院Fernando J. Bustos等合作在BMC Biology 在线发表题为“Removal of a partial genomic duplication restores synaptic transmission and behavior in the MyosinVA mutant mouse Flailer”的研究论文，该研究发现去除部分基因组复制恢复肌球蛋白VA突变小鼠Flailer的突触传递和行为。使用ASD和焦虑小鼠模型Flailer，其中包含部分基因组重复工作作为MyoVa的显性阴性，作者证明了在体外和体内使用DN-CRISPRs去除700 bp的基因组区域。重要的是，DN-CRISPRs尚未用于使用偏移量大于300 bp的sgRNA去除基因组区域。
该研究发现编辑初级皮质神经元中的Flailer基因可以恢复突触运输和传递缺陷。此外，在Flailer动物中被破坏的长期抑郁(LTD)在基因编辑后得到恢复。在体内传递DN-CRISPRs表明，局部传递到腹侧海马体可以恢复一些突变行为，而脑室内传递则完全恢复Flailer动物与焦虑和ASD相关的表型。该研究表明，DN-CRISPR有潜力有效地去除较大的基因组重复，作为治疗神经退行性疾病的新基因治疗方法。
另外，2023年9月18日，博德研究所Victoria Madigan、张锋及乔治亚理工学院和埃默里大学James E. Dahlman合作在Nature Reviews Drug Discovery（IF=120）在线发表题为“Drug delivery systems for CRISPR-based genome editors”的综述，该综述回顾了基于CRISPR的基因组编辑器的药物递送系统，重点是腺相关病毒和脂质纳米颗粒。在描述了这些系统是如何设计的以及它们在临床前动物模型中的后续特征之后，该送上重点介绍了最近临床试验的数据。该综述还讨论了由聚合物、蛋白质(包括病毒样颗粒)介导的临床前靶向，以及未来可能递送CRISPR系统的其他载体（点击阅读）。
2023年8月23日，博德研究所张锋团队在Nature Communications 在线发表题为“Cell type-specific delivery by modular envelope design”的研究论文，该研究开发了DIRECTED(Delivery to Intended REcipient Cells Through Envelope Design)，这是一个模块化平台，由单独的融合和靶向组件组成。为了实现高模块化和可编程的细胞类型特异性，该研究开发了多种策略来招募或固定病毒包膜上的抗体，包括嵌合抗体结合蛋白和SNAP标签，可以使用抗体或其他蛋白质作为靶向分子。此外，该研究发现来自多个病毒家族的融合原与DIRECTED兼容，并且DIRECTED成分可以靶向多种递送底盘(例如，慢病毒和MMLV gag)到特定的细胞类型，包括PBMCs和全血中的原代人T细胞（点击阅读）。
2023年4月5日，博德研究所张锋及东京大学Osamu Nureki等团队合作在Nature 在线发表题为“Cryo-EM structure of the transposon-associated TnpB enzyme”的研究论文，该研究报道了耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）ISDra2 TnpB及其同源ωRNA和靶DNA复合物的冷冻电镜结构。在结构上ωRNA采用了一种意想不到的结构，形成了一个假结，在所有Cas12酶的引导RNA中是保守的。此外，该结构以及功能分析揭示了紧凑的TnpB如何识别ωRNA并切割与向导互补的目标DNA。TnpB与Cas12酶的结构比较表明，通过不对称二聚体形成或多种REC2插入，CRISPR-Cas12效应物获得了识别引导RNA-靶DNA异源双链体的原间隔-邻近基序-远端的能力，从而参与CRISPR-Cas适应性免疫。总的来说，该研究提供了TnpB功能的机制见解，并推进了我们对从转座子编码的TnpB蛋白到CRISPR-Cas12效应物的进化的理解（点击阅读）。
2023年6月28日，博德研究所张锋团队在Nature 在线发表题为“Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease”的研究论文，该研究报告了Fz的生化特性，表明它是一种RNA引导的DNA内切酶。该研究还表明Fz可以被重新编程用于人类基因组工程应用。该研究利用冷冻电镜分析了Spizellomyces punctatus Fz (SpuFz)在2.7Å的结构，揭示了Fz、TnpB和Cas12之间的核心区域的保守性，尽管同源RNA结构不同。总之，该研究结果表明Fz是真核生物的OMEGA系统，表明RNA引导的内切酶存在于生命的所有三个领域（点击阅读）。
2023年4月6日，博德研究所张锋团队在Science 在线发表题为“Structure of the R2 non-LTR retrotransposon initiating target-primed reverse transcription”的研究论文，该研究报道了Bombyx mori R2 non-LTR逆转录转座子在其核糖体DNA靶点处启动TPRT的冷冻电子显微镜结构。目标DNA序列在插入位点被解开，并被上游基序识别。逆转录酶(RT)结构域的延伸识别逆转录转座子RNA，并引导3 '端进入RT活性位点以模板逆转录。该研究使用Cas9在体外将R2重定向到非原生序列，这表明未来可以作为一种基于可重编程RNA的基因插入工具（点击阅读）。
2023年3月29日，博德研究所张锋团队在Nature 在线发表题为“Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system”的研究论文，该研究发现Photorhabdus毒力盒(PVC)——来自昆虫病原细菌Photorhabdus asymbiotica的eCIS——的目标选择是由PVC尾纤维的远端结合元件对目标受体的特异性识别介导的。在尾巴纤维的结构引导工程中，该研究表明PVC可以被重新编程，以靶向这些系统不天然靶向的生物(包括人类细胞和小鼠)，效率接近100%。最后，该研究发现PVC可以装载不同的蛋白质载荷，包括Cas9、碱基编辑器和毒素，并可以将它们功能性地输送到人类细胞中。总之，该研究结果表明PVC是一种可编程的蛋白质传递装置，可能应用于基因治疗、癌症治疗和生物控制（点击阅读）。
2023年1月5日，博德研究所/哈佛医学院/麻省理工学院张锋团队在Cell在线发表题为“A transcription factor atlas of directed differentiation”的研究论文，为了全面了解TF及其控制的程序，该研究创建了一个包含所有注释的人类TF剪接异构体的条形码库(> 3500)，并将其应用于构建TF图谱，以单细胞分辨率绘制过表达每个TF的人类胚胎干细胞(hESCs)的表达谱。该研究将TF诱导的表达谱映射到参考细胞类型，并验证候选TF用于生成不同的细胞类型，涵盖所有三个胚层和滋养层。具有库子集的靶向筛选使研究人员能够创建定制的细胞疾病模型，并整合mRNA表达和染色质可及性数据，以识别下游调控因子。最后，该研究通过开发和验证一种预测TF组合的策略来描述组合TF过表达的影响，该策略产生匹配参考细胞类型的目标表达谱，以加速细胞工程工作（点击阅读）。
基因组重组事件，特别是拷贝数变异，与神经退行性疾病，如阿尔茨海默病，特别是自闭症谱系障碍(ASD)密切相关。事实证明，使用基因编辑工具靶向这些序列具有挑战性，因为编辑基因组复制也可能影响已复制基因的内源性拷贝。因此，在不改变野生型基因的内源性拷贝的情况下，确定编辑基因组复制的新策略为未来的治疗方法带来了希望。
近年来，CRISPR/Cas9的发现和发展使基因组的多种操作成为可能。在CRISPRs中，双缺口CRISPRs (DN-CRISPRs)已成为基因组编辑中获得靶向特异性的替代方法。DN-CRISPRs利用SpCas9n (Cas9n)，一种SpCas9 (D10A, Cas9)的突变形式，而不是产生双链断裂，只能切割一条DNA链。这个缺口可以被细胞有效地修复，而不需要引入基因突变。为了成功编辑基因组，它利用两个sgRNA，它们必须靶向所需基因组位点上的相反DNA链。先前的研究表明，当两个sgRNA之间的分离或偏移超过100 bp或最多300 bp时，切除效率降低，限制了该方法的使用。
将FL1 AAV注射到腹侧海马体中，可实现高效的Flailer基因编辑（图源自BMC Biology ）
Flailer小鼠被鉴定为携带自发非同源重组事件的小鼠模型，该事件导致一个额外的基因Flailer，由混合内含子融合在一起的gnb5基因的启动子和外显子1-2与myo5a基因的外显子26-40融合组成。在Flailer动物中，细胞在9号染色体上含有内源性的gnb5、myo5a和Flailer基因拷贝。Flailer融合蛋白的表达受gnb5基因启动子控制，在中枢神经系统(central nervous system, CNS)中广泛高表达。得到的Flailer蛋白与货物结合，但缺乏肌动蛋白结合结构域MyosinVa，这是结合和行走到肌动蛋白丝的正端所必需的。在野生型神经元中，MyosinVa在将突触复合体的各种成分(包括支架蛋白、受体和mRNA)运输到树突棘中起着至关重要的作用。这一过程对于突触的正常功能和可塑性至关重要。
当Flailer蛋白与野生型myosina以1:1的比例存在时，它作为显性阴性蛋白，导致受体和支架蛋白(如PSD95和AMPA受体)的运输减少和突触聚集异常。重要的是，从理论上讲，移除Flailer基因的至少一个拷贝可能导致表型的恢复。先前的研究表明，Flailer神经元突触棘数量减少，AMPA受体介导的电流增加，视觉皮层和海马缺乏长期抑制(LTD)。在FL动物中观察到的突触活动增强是LTD缺失的结果。这种LTD的缺乏导致无法修剪突触，导致树突轴中形成新的突触接触。这是由于受体和支架在这些区域的广泛分布，因为到脊柱的运输受到损害。此外，由于突触缺陷，Flailer小鼠表现出与ASD和焦虑相关的行为，如重复梳理、癫痫发作、记忆缺陷和焦虑样行为增加。Flailer小鼠模型提供了一个独特的机会来解剖不同大脑区域在控制行为中的作用。由于Flailer小鼠的整个大脑都携带了这种突变，移除特定大脑区域的重复使得能够确定大脑区域在控制特定行为方面的充充性，并研究其潜在的神经回路。
该研究通过证明DN-CRISPRs在切除长度大于100 - 700 bp的基因组区域中的有效性，扩展了其应用。这不仅扩大了基因编辑技术的视野，而且还利用了DN-CRISPR提供的增强精度。利用AAV病毒传递，在消除Flailer部分基因组重复方面表现出显著的基因编辑效率(约60%)。大量的编辑水平使Flailer小鼠的ASD/焦虑相关表型得以恢复。总的来说，该发现强调了DN-CRISPR作为纠正基因组畸变的创新治疗途径的潜力。
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https://doi.org/10.1186/s12915-023-01714-y
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