原文题目：Gut microbiota impacts bone via Bacteroides vulgatus-valeric acid-related pathways
通讯作者：Hong-Wen Deng
隶属单位：杜兰大学医学院戴明医学系杜兰生物医学信息学和基因组学中心
DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-023-42005-y
骨质疏松症（OP）的主要特征是骨密度（BMD）低和对低创伤性骨折的易感性增加，在绝经后妇女中最为普遍（称为绝经后骨质疏松症（PMOP））。美国有 2000 万绝经后妇女患有骨质疏松性骨折，与 OP 相关的住院费用超过了心肌梗塞、卒中和乳腺癌的费用。PMOP和OP的致病机制尚不清楚，目前的干预和治疗方案并不完全令人满意。人体研究侧重于OP的固有（例如，（表观）基因组，转录组，蛋白质组，代谢组）和外部（例如，环境，医疗/药物/营养，生活方式）危险因素的潜在影响。然而，最近，实验动物模型已经确定了肠道微生物群（GM）和骨骼之间的强烈关联。例如，Sjogren等人发现，小鼠中缺乏转基因会导致骨量增加，在正常的转基因定植后恢复正常。在人类中，一些早期研究表明转基因对骨骼健康的潜在重要性。在其中一项研究中，Ni等人根据TwinsUK，LifeLines-DEEP和UK生物银行队列进行了全基因组关联研究（GWAS）汇总统计的双样本孟德尔随机化（MR）分析。他们确定了细菌特征（目和家族水平）与通过足跟定量超声测量的人类BMD之间的潜在因果关系，尽管没有进行体外/体内实验来验证这些发现。其他早期研究主要受到小样本量的限制。因此无法识别特定的细菌种类和/或相关的功能机制。
图1：细菌种类组成及细菌种类、SCFAs和BMD之间的关联。
为了鉴定物种水平上的重要肠道细菌，以及它们影响骨骼健康的功能机制，研究人员对517名围绝经期和绝经后中国女性的人类基因组、转基因和靶向代谢组[血清短链脂肪酸（SCFAs）]进行了系统的整合多组学分析。虽然许多先前的OP研究都比较了低/高BMD组，但病例对照设计通常会降低统计功效，因为选择人为的临界值进行组选择会丢失信息12.为了充分利用整个样本，从而增强统计能力（与病例对照分析相比），研究人员探索了GM，SCFA和连续BMD值之间的关联。研究人员确定了几种细菌种类，SCFA和功能途径，这些细菌物种，SCFA和功能途径显着影响BMD。研究人员验证了美国白人的主要结果，并研究了单个细菌物种和SCFA在体外培养细胞和小鼠体内调节骨代谢的因果作用。研究结果为通过GM和代谢组改变潜在预防/干预/治疗OP奠定了基础。
研究人员在人类研究中发现：（1）转基因生物多样性和几种细菌代谢途径与BMD呈负相关;（2）几种细菌物种（特别是B. vulgatus）在不同种族人群中与BMD显着相关;（3）血清VA水平与L1-L4 BMD呈正相关;（4）外隐双歧杆菌与血清VA水平呈负相关，可能通过抑制肠道内产生VA的细菌的生长来抑制VA水平。
随后的体内和体外研究发现：（1）在喂食外双歧杆菌的OVX小鼠中，VA水平降低，而骨吸收增加;（2）VA抑制OVX小鼠的骨吸收;（3）VA抑制破骨细胞样细胞的成熟，促进成骨细胞的成熟和成骨细胞体外的细胞外基质矿化;（4）体外破骨细胞样细胞和成骨细胞的VA治疗抑制了RELA蛋白的产生（促炎），增强了IL10 mRNA表达（抗炎）。因此，外隐双歧杆菌似乎通过减少肠道内VA的产生来降低BMD，从而增强炎症和破骨细胞活性，并降低成骨细胞活性。在研究人员的发现样本中，转基因生物多样性与前臂BMD之间的负相关与以前的报告一致。研究还表明，无菌小鼠（不存在的转基因生物多样性）的骨量高于正常转基因小鼠，并且在生命早期对小鼠进行抗生素治疗减少了转基因生物多样性并增加了骨骼大小。尽管人们普遍认为转基因生物多样性是有益的，上述结果表明，转基因生物多样性对健康的影响可能因不同的表型性状、环境因素（如饮食和运动）和转基因内个体物种组成而异。
在这项研究中，B. vulgatus是发现与BMD相关的单个细菌物种之一。B. vulgatus是哺乳动物（包括小鼠和人类）肠道中最丰富的细菌物种之一;它属于拟杆菌属，人类微生物组中最丰富的属之一。外隐双歧杆菌可触发促炎NF-κB信号通路与骨重塑有关。研究人员没有观察到外隐双歧杆菌对假手术小鼠组的影响，这表明外隐双歧杆菌可能对真性腺小鼠和雌激素缺乏小鼠有明显的影响。由于更年期是女性健康变化的关键时期（例如，心血管和代谢疾病的风险增加）而 B. vulgatus 是一种机会性病原体，研究人员推测，粗双歧杆菌主要在雌激素缺乏的条件下对BMD产生有害影响。这种推测与外隐双歧杆菌伴多囊卵巢综合征相关卵巢功能障碍升高的报道一致。
图3：戊酸影响小鼠体内骨骼相关表型。
尽管发现队列显示外隐双歧杆菌与脊柱 BMD 的关联，而复制队列表明与髋部 BMD 相关，但不同骨骼部位的 BMD 关联结果可能不同，这并不罕见，实际上在流行病学研究中很常见。这在遗传流行病学研究中尤其正确并被广泛观察到。一个突出的例子是WNT16基因（与该领域发现的BMD最强大的相关基因）的关联。在一些研究中，WNT16 与欧洲血统和亚洲人群的髋关节骨密度相关，在其他研究中，欧洲、西班牙裔美国人和非裔美国人的腰椎骨密度，以及其他研究中欧洲人的前臂骨密度。人们普遍认为，不同部位的BMD是相关的，可以一起或单独地反映一般骨骼健康。此外，严格的单侧星座测试结果也明确支持，总体而言，中国和美国队列中庸双歧杆菌与BMD之间存在显著的负相关。此外，在人类队列中，B. vulgatus和BMD之间的关联和部分验证主要是为了发现与后续功能验证实验相关的信息。在基于人类关联分析的发现之后，研究人员随后通过各种体内和体外实验验证了结果。综上所述，这些集体结果为外隐双歧杆菌对BMD和骨代谢的重要性提供了强有力的证据。
为了确定GM如何影响BMD，研究人员研究了GM功能能力和BMD变异之间的关系。大多数与BMD负相关的GM功能模块涉及GM代谢。与人体代谢相反，这些与BMD相关的转基因代谢模块对细菌活性至关重要。具体来说，M00002，M00003和M00855涉及糖酵解途径或糖异生，两者都影响葡萄糖代谢，对细菌细胞能量至关重要。M00048和M00050都涉及细菌生长所需的核酸合成。这些集体发现表明，人类骨骼健康受到转基因的影响，特定的细菌生物合成/代谢途径有助于这些影响。
由于几种转基因功能模块与BMD相关，微生物代谢物有助于宿主-微生物组相互作用，研究人员探讨了BMD和血清SCFAs之间的关系。SCFA仅由转基因产生，在结肠中吸收，并作为宿主和转基因之间的关键信号分子发挥作用。丁酸是研究最广泛的骨骼健康SCFA，据报道可抑制小鼠破骨细胞分化和骨吸收，尽管研究人员在这项研究中没有发现丁酸和BMD之间的显着关联。然而，研究人员确实证明了VA的重要作用。据报道，VA可抑制组蛋白去乙酰化酶（HDAC），HDAC是一种对基因表达的表观基因组调控很重要的酶。HDAC与许多疾病（例如癌症、结肠炎、心血管疾病和神经变性）的发病机制有关，HDAC抑制剂被认为是潜在的治疗药物。在照射小鼠中，VA可以保护造血器官，改善胃肠道功能，增强肠上皮完整性，提高存活率。在目前的研究中，研究人员首次提供了证据表明VA可能用于治疗OP。研究人员发现VA与人类BMD呈正相关，抑制OVX小鼠骨吸收，抑制破骨细胞样细胞分化，促进成骨细胞体外分化和矿化。这些集体结果支持VA对BMD的保护作用。
图4：戊酸在体外影响破骨细胞样细胞和成骨细胞分化。
通过进一步的实验，研究人员发现VA的保护作用部分归因于IL10表达增加（抗炎）和抑制p-RELA表达（促炎）介导的破骨细胞活性降低和成骨细胞活性增加，以及p-NFKBIA和p-CHUK / IKBKB表达的上调。NFKBIA阻止RELA转移到细胞核，使其保持非活动状态。这与先前的报道一致，即SCFAs通过抑制NF-κB信号通路和增加IL10表达来减少巨噬细胞诱导的炎症。IL10抑制NF-κB活性，促进炎症，导致骨质流失，抑制成骨细胞，从而减少骨形成。该信息表明，抑制NF-κB信号通路可能在VA抑制破骨细胞活性但增强成骨细胞活性的这些过程中发挥作用。尽管RAW264.7细胞的体外研究表明，VA处理组的TNF（炎性细胞因子）的mRNA水平高于对照组，研究人员怀疑这可能是由于RAW264.7细胞数量增加释放的TNF基础水平。VA抑制RAW264.7细胞分化为破骨细胞样细胞，与单独使用RANKL治疗的组相比，产生更多的RAW264.7细胞。由于这是第一项报告VA对绝经后BMD的保护作用的研究，关于VA影响BMD的潜在机制的其他问题提供了新的研究机会，具有影响OP治疗的巨大潜力（例如，微生物群-SCFA无脂肪酸受体[FFAR]信号级联反应可能是VA的潜在机制，因为FFAR4和FFAR2是SCFA的特异性受体。由于外隐双歧杆菌和VA都与BMD相关，研究人员试图确定外隐双歧杆菌是否通过降低VA水平来调节骨代谢。人类数据中外隐芽孢杆菌/产VA益生菌/VA的关联和MR分析结果提供了证据，支持外隐双歧杆菌相对丰度与血清VA水平之间的潜在因果关系。虽然VA对健康很重要，但循环血液中的生理浓度通常较低。已知在中断后，小鼠的转基因恢复迅速。这可能抵消了外隐双歧杆菌对VA的抑制作用，并解释了研究人员在外隐双歧杆菌强饲后观察到的VA相对轻微的降低。研究人员计划在未来进行体内实验，增加样本量和各种剂量/频率的外氏双歧杆菌管饲法，这将对潜在的临床研究具有转化意义。
补充益生菌有益于肠道健康，可能是预防和/或治疗骨质流失的有效治疗方法。在目前的研究中，研究人员观察到B. vulgatus与产生VA的微生物（益生菌）之间存在负相关关系。VA改善BMD，而B. vulgatus似乎通过抑制产生VA的微生物的生长来降低BMD，从而抑制VA水平。因此，探索产生VA的微生物（益生菌）防止OVX诱导的骨质流失的潜力可能是OP干预研究的一种创新方法。进一步的机理研究集中在B. vulgatus通过产生VA的微粒对VA产生的调节（例如，不同转基因物种之间的竞争和合作相互作用）应在将来执行。此外，可能还有其他潜在的途径，B. vulgatus调节BMD需要进一步探索。例如，B. vulgatus可以改变胆汁酸代谢并减少IL22的分泌，从而增加卵巢功能的破坏和胰岛素抵抗对宿主健康的影响。胆汁酸代谢、卵巢功能和胰岛素抵抗都与 OP 相关。
图5：外隐双歧杆菌通过VA产生和NF-κB信号通路对骨的机制。
在数据分析过程中，为了确信结果不太可能是虚假相关性，研究人员计算了对大多数p值进行多次测试校正的错误发现率。研究人员没有对约束线性回归分析的p值进行错误发现率，因为所有细菌物种都在同一模型中进行了测试。尽管由于样本量的限制，研究人员可能没有使用最严格的显著性阈值来鉴定重要的细菌种类，但研究人员通过随后的体内和体外实验成功地验证了发现结果，从而为整个研究提供了集体可靠的结果。
研究人员的研究有几个优势。首先，据研究人员所知，这是目前最大的霰弹枪宏基因组学研究，直接测试了转基因和人类BMD之间的关联。其次，研究人员使用严格的纳入和排除标准来确保受试者在年龄、卵巢功能和生活环境方面相对同质，从而最大限度地减少潜在的混杂因素，并从实证上增强研究人员研究的统计能力。第三，利用创新的多组学方法，对转基因与人类BMD相互作用的串扰、相互作用和因果推断有全面的了解，确定了导致转基因与BMD关联的功能机制，为多组学大数据提供了坚实的支持。最后，研究人员利用统计学和实验证据证明了特定细菌种类和转基因衍生代谢物对BMD变异和调控的影响，以及特定肠道细菌种类对人血清中转基因衍生代谢物的因果影响。还有一些限制需要注意。例如，研究人员在美国白人验证队列中没有血浆SCFA分析。
总之，研究人员开创了一种创新和全面的多组学方法，用于在中国队列中发现GM，SCFA和人类BMD之间的关联，然后进行体外和体内功能验证实验，并在独立的美国白人队列中进行复制。研究人员成功地鉴定并验证了与人类BMD显着相关的单个肠道细菌物种及其衍生代谢物。研究人员证明了B. vulgatus似乎通过其对VA产生的影响在调节骨代谢中起着关键作用。反过来，VA抑制OVX小鼠的骨吸收，促进成骨细胞的分化和矿化，并抑制破骨细胞分化和炎症反应。研究人员的研究结果从人类微生物群及其功能产物SCFAs在人血清中对OP的病理生理机制提供了重要的见解，并提出了潜在的新型生物标志物（例如，VA）和治疗靶点（例如，从肠道中消除外隐芽孢杆菌;膳食补充VA）在女性随着年龄增长的关键绝经期预防/干预/治疗。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-023-42005-y
转自：“生物医学科研之家”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
