第一作者：赵美娟
通讯作者：李子富、周晓琴
DOI：10.1016/j.ecoenv.2023.115212
成果简介
抗生素耐药性对人类健康存在潜在危害而逐渐受到关注。污水处理厂作为抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes, ARGs)的源与汇，是去除ARGs的重要节点。UV-LED(紫外发光二极管)由于其不含汞无二次污染、能够提供单一波长的优点成为替代传统紫外汞灯的新兴技术。本研究中使用单独265 nm作用、单独 285 nm UV-LED作用及不同强度的265 nm与285 nm UV-LED组合去除三种ARGs（tet A、cat 1与amp C）。使用实时定量qPCR、流式细胞仪及透射电子显微镜（TEM）分析了ARGs的去除效率、基因行为和可能存在的机制。单独265 nm UV-LED在紫外线剂量累积为500 mJ/cm2时，分别去除了1.91、1.71及1.45 log的tet A、cat 1与amp C。紫外辐照对细胞膜损伤不明显，但是检测到基因由胞内向胞外的泄露，最多增加了0.69 log。照射过程中产生了ROS，ROS与细胞内的ARGs呈强负相关，可促进ARGs的去除。因此在UV-LED辐照过程中，ARGs的去除包括UV-LED直接辐照、泄露及ROS氧化。
图1. 实验装置示意图。
本研究搭建了实验装置如图1所示，可通过调节电流改变UV-LED辐照强度，设置五组实验（表1），探究单波长UV-LED辐照与多波长UV-LED辐照去除ARGs的效率及细胞行为。
表1 实验组别。
图2.三种抗性基因在五组实验条件下的去除效率。（a）tet A，（b）cat 1，（c）amp C。
3种ARGs的细胞内基因去除情况如图2所示。对于图2(a)中的tet A，在累积紫外线剂量为500 mJ/cm2时，S1、S2、C1、C2和C3的最终对数去除效率分别为1.91 log、1.47 log、1.62 log、1.50 log和1.62 log。对于图2(b)中的cat 1, S1、S2、C1、C2和C3的对数去除效率分别为1.71log、0.98 log、1.26 log、1.22 log和1.25 log。对于图2(c)中的amp C, S1、S2、C1、C2和C3的去除效率分别为1.45 log、0.85 log、0.96 log、0.88 log和1.05 log。单独265 nm UV-LED对三种基因的去除效率最高，单独285 nm UV-LED去除效率最低。此外，组合波长下的基因去除效率不如单一的265 nm UV- led。
对5组实验去除tet A、cat 1和amp C的每个重复实验分别线性拟合，tet A的k均值在0.0028-0.0043之间，cat 1的k均值在0.0019-0.0037之间，amp C的k均值在0.0019-0.0022之间，各组tet A的k值无显著差异，说明作用方式对tet A去除的影响可以忽略不计。但对于cat 1和amp C, 5组实验的k值之间存在差异p < 0.05 (cat 1: F (4,14) = 28.261, p < 0.001;amp C: F (4,14) = 21.839, p < 0.001)。对于cat 1, Tukey HSD检验显示，S1的k值(M=0.0037, SD=0.0004)与其他4组实验相比有显著差异。S2的k值(M=0.0019, SD=0.0002)与S1、C1、C2差异显著。C1、C2和C3之间的差异不显著。对于amp C, S1的k值(M=0.0033, SD=0.0002)与其他四组实验差异显著，S2、C1、C2、C3之间差异不显著。这些结果表明，单独265 nm UV-LED (S1)具有去除cat 1和amp C的优势。
图3. 5组实验 (S1、S2、C1、C2、C3) 作用下细胞外ARGs浓度的变化。(a) tet A;(b)cat 1;(c)amp C。
随着紫外线剂量的增加而逐渐降低。胞外tet A的浓度在累积UV剂量为100 mJ/cm2时达到峰值，除C2外，S1、S2、C1和C3的浓度分别增加了0.28 log、0.10 log、0.09 log和0.08 log。此时细胞内基因浓度分别降低0.83 log、0.34 log、0.97 log、0.79 log。因此，细胞内ARGs在UV-LED辐照过程中泄漏。最后，S1、S2、C1、C2和C3的浓度分别降低了0.83 log、0.31 log、0.61 log、0.46 log和0.26 log。cat 1和amp C的行为略有不同。通过对每组重复实验的细胞外ARGs浓度的平均偏差和单因素方差分析表明，辐照条件显著影响细胞外ARGs浓度，包括泄漏和去除。细胞外ARGs浓度在S1即265 nm UV-LED 中波动较大。细胞外ARGs由于没有细胞结构的保护，因此比细胞内ARGs对UV-LED更敏感，因为它逃脱了细胞结构的保护，但细胞外基因略有减少甚至保持稳定，表明基因降解和泄漏是并行的。
图4. 5组实验 (S1、S2、C1、C2和C3)下细胞膜完整及酯酶活性高的细胞浓度。样本•代表细胞膜完整细胞，ê代表高酯酶活性细胞。
完整膜细胞和高酯酶活性细胞在五组实验作用下的变化如图4所示。在辐照过程中，细胞几乎保持完整，在所有实验组别中，完整细胞的最大减少量为1.3 log。出乎意料的是，单独265 nm UV-LED对细胞膜的损伤比285 nm的更大，分别对应1.19 log和0.33 log。众所周知，DNA/RNA的吸收峰出现在265 nm，蛋白质/酶的吸收峰出现在285 nm，因此，285 nm UV-LED可以直接攻击细胞膜。值得注意的是，在低剂量(100 mJ/cm2)下，265 nm和285 nm之间的膜损伤没有差异，因此这种差异可归因于高剂量。265 nm的UV-LED直接破坏了基因表达，对细胞有致死作用，但死亡细胞失去了通透性，因此对细胞膜的损伤比285 nm的更大。细胞外tet A浓度与完整细胞呈显著正相关(0.83，p<0.05)。高酯酶活性的细胞在辐照过程中略有下降。即使紫外线照射后细胞膜的完整性丧失，细胞仍能保持酯酶活性。然而，单个285 nm对酯酶活性的抑制效果最好，这可能是因为蛋白质的峰值出现在285 nm处。
图5. 细胞结构在265 nm 与285 nm UV-LED共同辐照下的透射电镜图像。(a)初始大肠杆菌;(b) 100 mJ/cm2;(c) 300 mJ/cm2;(d) 500 mJ/cm2。
通过TEM观察C1实验组细胞形态变化 (图5)。一开始，细胞壁和膜双层结构完好，可能是抗生素的作用和离心过程的高速导致细胞壁有轻微折叠。紫外线照射后，细胞质固化发生改变，这一过程从细胞膜开始，但细胞壁保持完整性，因此在较低的紫外线剂量(100 mJ/cm2)下，对表面结构变化的损伤不明显。当紫外线照射剂量增加(300 mJ/cm2)时，细胞膜出现空泡，但未见明显损伤。当剂量达到500 mJ/cm2时，细胞壁明显受损，部分细胞质流出，细胞完全死亡。因此，高紫外线剂量会造成不可逆的细胞膜损伤。此外，细胞损伤仅与累积剂量有关，高剂量下UV波长整合对代谢活性影响较小。透射电镜结果进一步证明，即使细胞结构完整，基因泄漏也可能是由通透性改变引起的。
图6. 流式细胞术测定5组实验条件(S1、S2、C1、C2、C3)下细胞内ROS水平直方图。采用DCFH-DA染色，认为荧光强度大于103的细胞ROS水平较高。
正常情况下，细胞会激活其应急系统来抵抗外部攻击，从而使ROS逐渐增加，然后在细胞失去代谢后减少。流式细胞术测定细胞ROS水平发现，在所有五个实验场景中，ROS在照射时间内都持续增加而不减少。在照射开始时(UV剂量累积到100 mJ/cm2)， ROS浓度迅速升高，表明ROS的生成和氧化与UV-LED直接照射同步存在。随着辐照时间增长，ROS浓度的增加速度减慢，这可能是因为ROS的消耗速度较快。活性氧可以通过两种方式产生，即通过紫外线照射直接产生和通过水基质间接产生。直接产生的方式是吸收入射紫外线，在组分上形成激发态，生成⋅OH，该部分ROS存在于细胞内。间接ROS可以由水中溶解氧和有机物在紫外线照射下产生，主要是细胞外ROS。本研究中，C1、C2、S1、S2、S3的高ROS水平细胞分别增加0.61 log、0.59 log、0.61 log、0.47 log、0.64 log。
综上所述，在本研究中，265 nm UV-LED是去除ARG最有效的处理方法，在500 mJ/cm2的剂量下，tet A、cat 1和amp C的对数分别降低了1.91、1.71和1.45 log，而在相同剂量下使用组合UV-LED波长时，没有发现强化效果。在所有UV-LED辐照条件下，细胞内ARGs都向细胞外渗漏，即使膜损伤不明显。细胞外和细胞内ARGs之间存在平衡，在某些情况下，细胞内ARGs的泄漏抑制了细胞外ARGs的降解。高剂量UV-LED辐照刺激细胞内ROS生成，高ROS水平细胞浓度增加0.47~0.64 log，促进细胞内ARGs降解。然而，细胞内ROS对基因去除的作用机制尚不清楚，需要进一步探索。本研究可为UV-LED去除ARGs提供相关的理论依据，今后应将重点放在265 nm UV-LED的优化和增强上。
作者简介
第一作者：赵美娟，硕士，毕业于北京科技大学能源与环境工程学院。研究方向为污水深度处理。以第一作者在Ecotoxicology and Environmental Safety发表论文。联系邮箱：13021952099@163.com。
通讯作者：李子富，博士，教授，毕业于德国汉堡科技大学。北京科技大学环境工程系主任，研究方向为生态污水系统的研究，特别是分流污水处理技术和污水回用技术的研究。以第一或通讯作者在Science of the Total Environment，Water research，Journal of Hazardous Materials、Frontiers in Environmental Science等国际知名期刊发表论文若干篇。联系邮箱：zifulee@aliyun.com。
通讯作者：周晓琴，博士，副教授，毕业于北京科技大学。研究方向为生态厕所中源分离尿液资源化无害化关键技术研究、污水消毒技术研究与应用，以第一或通讯作者在Science of the Total Environment、Resources Conservation and Recycling、Environmental Research、Bioresource Technology等国际知名期刊发表论文。联系邮箱：zhouxiaoqin025@163.com。
文章链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0147651323007169
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