以下文章来源于龙师兄实验室 ，作者龙师兄
疑问：
查询免疫印迹膜的时候，发现可供选择的有聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride，PVDF膜）和硝酸纤维素膜（NC膜）。但实际做实验的时候，通常使用PVDF膜而非NC膜，这是为什么？
NC膜与PVDF膜的区别：
膜的选择，印迹所使用的膜的类型可能影响下列因素：
•蛋白质结合能力
• 是否需要用醇预湿
• 蛋白质观察
• 长期印迹保存
• 信噪比
• 开展多次剥离（stripping）和再生检测（reprobing）实验的能力
NC膜和PVDF膜是Western blotting中最常用的两种膜。NC膜是世界上使用最为广泛的特异性转移介质之一，也是最早用于Western blotting的膜。PVDF膜在1985年被开发出来，在严苛条件下表现出更高的蛋白保留，比如有机溶剂存在时，或者在酸性或碱性条件下。
NC膜与蛋白质之间靠静电和疏水作用结合，NC膜是亲水膜，无需预先活化，对蛋白质的活性影响小；背景低；价格低廉，使用方便。缺点是韧性较差，易损坏，不能反复使用。在非离子型去污剂作用下，结合的蛋白容易被洗脱下来。
PVDF膜与蛋白质之间靠疏水作用结合，与NC膜相比，PVDF膜有着更高的机械强度和出色的化学稳定性，适合多次剥离（stripping）和反复检测（reprobing）。同时，PVDF膜有着更高的结合能力，NC膜的典型结合能力是80 -100 μg/cm2，而PVDF膜达到150-160 μg/cm2 （结合强度 PVDF膜比NC膜强 6 倍），这意味着灵敏度更高。由于PVDF膜的疏水性，成为疏水蛋白质（如膜蛋白）的首选。也正因为如此，PVDF膜需要甲醇润湿才能被常规的转膜液所浸润，继而进行转膜与蛋白结合。
综上，现阶段实验室印迹转印膜常用PVDF膜而非NC膜。
PVDF膜结合蛋白的机理：
在分子水平，蛋白质吸附至少部分源于疏水氨基酸侧链与聚合物表面疏水区的相互作用。Matsudaira（1987）观察到，在疏水残基被切割之后，小肽的测序效率下降80%，这可能是由于残余肽段被洗脱。同时，在肽段消化降解时，也观察到疏水肽段往往不能像亲水肽段那样高效洗脱（Iwamatsu，1991；Fernandez等，1992）。McKeon和Lyman（1991）发现，转印缓冲液中添加的Ca2+离子可增强钙调蛋白与Immobilon®-P转印膜的结合。钙的结合导致蛋白质分子结构中形成一个疏水袋，从而增加蛋白与膜的结合。
综上，PVDF膜结合蛋白的机理：PVDF膜的表面具有疏水性，而许多蛋白质也具有疏水性区域，PVDF膜表面和蛋白质疏水区域之间发生疏水作用导致其相互结合。
PVDF膜为什么需预先活化：
PVDF膜本质是一种疏水性的聚合物，具有疏水性且不带电荷，不能被转膜液所浸润，为了在水性缓冲液中使用，需要在使用前进行预处理以浸润和活化膜。最常见的方法是使用50%（v/v）或更高浓度的醇（甲醇、乙醇和异丙醇）溶液浸润和活化，使PVDF膜中微孔内的空气被低表面张力的甲醇所替代，从而易于后续水或者缓冲液进入PVDF膜中的微孔内，使PVDF膜从疏水性变成亲水性，随着膜的外观从不透明变为半透明，表明PVDF膜已经完全浸湿。之后用水反复冲洗以去除醇类，再将膜直接放入转印缓冲液中平衡。一旦膜被浸湿，通过电转移，蛋白质与膜接触产生疏水作用而被吸附在PVDF膜上。
PVDF膜孔径对蛋白结合的影响：
在电转移过程中，蛋白与膜的结合贯穿整个膜的厚度(深度)，结合能力是由孔的内部表面积来决定的（Mansfield，1994）。随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固，但是膜孔径如果小于0.1 μm，蛋白的转移就很难进行了，原因是蛋白质分子的直径大约在1-100纳米之间。
PVDF膜孔径越小对低分子蛋白吸附越牢固的机理：较小的孔径会限制蛋白分子的运动，使其转移速度变慢，蛋白与膜的结合更充分，更容易被拦截在孔道内。此外，较小的孔径也可以提供更高的膜表面积，从而提高了蛋白与膜接触的机会。同时，较小的孔径也可以提供更高的表面密度，从而增加了孔道与溶液之间的分子间吸引力，这种吸附方式称为“毛细作用”。Schweitzer和Kriz在一项研究中发现，较小的孔径可以提供更高的蛋白密度并增强其吸附能力。另一方面，蛋白分子量越低，蛋白的比表面积越大，与膜接触面越大越充分，结合更紧密。
通常情况下，大于20 kD的蛋白选择0.45 μm的膜，小于20 kD的蛋白选择0.2 μm的膜。0.2 μm PVDF膜内部表面积大约是0.45 μm PVDF 膜的三倍，使其吸附能力更高。总之，选择PVDF膜的孔径大小需要根据样品蛋白的大小和特性来确定，以获得最佳的结合效果。
题外：
1975年，Dr.Southern使用Merck Millipore的硝酸纤维素膜(NC膜)发明了Southern Blotting技术。
1979年，Dr. Towbin使用Merck Millipore的硝酸纤维素膜(NC膜)发明了Western Blotting技术。
1985年，Merck Millipore发明了世界上第一张0.45 μm PVDF膜（Immobilon-P）。
1988年，Merck Millipore发明了世界上第一张0.2 μm PVDF膜（Immobilon-PSQ），提高小分子蛋白检测效率。
2005年，Merck Millipore上市了世界上第一张0.45 μm 荧光检测专用PVDF膜 (Immobilon®-FL)。
截至2011年初应用Immobilon®转印膜的文献已经超过52,000篇，此后更是以几何级数增长。近年，Immobilon® PVDF转印膜长期保持市场占有率第一。
默克密理博目前提供四种PVDF膜：
• Immobilon®-P膜(0.45 μm)是一种通用的基质，适用于一般的免疫印迹应用。
• Immobilon®-PSQ膜(0.2 μm)适用于蛋白质测序和低分子量蛋白的免疫印迹。它有着更高的蛋白质结合能力以及比0.45 μm膜更高的截留率。
• Immobilon®-FL膜(0.45 μm)是为荧光免疫检测而开发的。它在多种激发和发射波长范围内的荧光背景都极低。
• Immobilon®-E膜(0.45 μm)是第一个用水性转移缓冲液润湿的蛋白质印迹PVDF膜，去除了其他PVDF膜所需的醇溶液预湿步骤。
转自：“医学科研小坑”微信公众号
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