导读
黄芪桂枝五物汤（HGWD）是《金匮要略》中的经典中药方剂，用于治疗血瘀，已在临床上用于缓解糖尿病周围神经病变（DPN）。然而，HGWD干预DPN的机制仍有待发现。本研究旨在通过整合血浆代谢组学和肠道微生物组，探讨HGWD干预DPN的机制。我们采用db/db小鼠DPN表型、坐骨神经病理形态学、足垫上皮内神经纤维（IENF）、血脂和氧化应激水平以及炎症反应等指标来评价HGWD的疗效。最后，本研究通过代谢组学和16S rRNA基因测序探讨了HGWD干预DPN的药理学机制。HGWD逆转db/db小鼠的DPN表型，改善外周神经结构，改善血浆中的血脂和神经生长因子水平，增强抗氧化能力，减轻炎症反应。血浆代谢组学揭示，HGWD显著调节参与鞘脂代谢、不饱和脂肪酸生物合成、花生四烯酸代谢和氨基酸生物合成途径的37种代谢产物的异常水平。肠道微生物组显示，9种细菌与HGWD改善DPN的疗效高度相关。微生物组和代谢组学的综合分析表明，四种细菌与四种代谢途径的相互作用可能是HGWD干预DPN的重要机制。肠道微生物群和血浆代谢的调节可能是HGWD改善db/db小鼠DPN的潜在机制。乳杆菌、拟普雷沃氏菌、拟杆菌和Desulfovibio与四种代谢途径的相互作用可能是HGWD治疗DPN的关键机制。
亮点：
1.首次结合代谢组学和微生物组学研究了HGWD干预DPN的机制。
2.HGWD可改善DPN的表型。
3.四种细菌与四种代谢途径的相互作用可能是HGWD治疗DPN的关键机制。
论文ID
原名：Integrating plasma metabolomics and gut microbiome to reveal the mechanisms of Huangqi Guizhi Wuwu Decoction intervene diabetic peripheral neuropathy
译名：结合血浆代谢组学和肠道微生物组学研究黄芪桂枝五物汤干预糖尿病周围神经病变的机制
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.10
通讯作者：林朝展&王美琪&卢其福
通讯作者单位：广州中医药大学，广州白云山潘高寿药业股份有限公司
实验设计
实验结果
1. HGWD改善小鼠DPN表型
鉴于HGWD的临床应用，我们系统地研究了HGWD在改善DPN小鼠神经系统疾病方面的药理作用。如图1A–D所示，DPN小鼠表现出典型的DPN表型，包括触觉感知水平上调、热潜伏期以及感觉神经传导速度（SNCV）和运动神经传导速度（MNCV）水平下调。HGWD有效地逆转了DPN小鼠的所有上述神经系统紊乱指标。即使HGWD可能略微降低这两个指数的水平，但HGWD对DPN小鼠的体重和空腹血糖（FBG）水平没有显著影响（补充材料图S1）。
图1 HGWD在神经方面有所改善。（A）触觉感知。（B）热潜伏期。（C–D）神经传导速度：SNCV（C），MNCV（D）。（E）对照、DPN、依帕司他（阳性药）和HGWD组小鼠坐骨神经的代表性电子显微照片。（F）坐骨神经g比值的散点图。（G）IENF密度的代表性图像和（H）足垫中IENF的定量（黑色箭头：IENF）。数据显示为平均值±SEM（n=8）。#P＜0.05，###P＜0.01，###P＜0.001；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
2. HGWD改善周围神经结构
DPN通常与不同神经的轴突变性有关，例如坐骨神经。我们用透射电子显微镜观察了坐骨神经的超微结构，以研究HGWD是否对轴突变性具有保护作用。如图1E所示，DPN小鼠表现出髓鞘的明显失活（红色箭头），并且可观察到空泡化的线粒体和自噬体（绿色箭头），HGWD处理后显著减轻了上述表型。此外，g比值被用来测量髓鞘的厚度，这被认为可以证明神经传导的能力。与对照小鼠相比，它在DPN小鼠中发生了显著变化，但被HGWD逆转（图1F）。
先前的一项研究表明，在DPN进展过程中，较低的MNCV和受损的感觉反应伴随着上皮内神经纤维（IENF）的损失。在小鼠足垫的免疫组织化学分析中，我们发现IENF在DPN小鼠中下调，在HGWD处理的DPN小鼠中上调（图1G–H）。
图2 HGWD改善了血脂和氧化应激水平。小鼠血浆中（A）总胆固醇(T-CHO)、（B）总甘油三酯(TG)、（C）低密度脂蛋白(LDL-C)、（D）高密度脂蛋白(HDL-C)、（E）超氧化物歧化酶(SOD)、（F）谷胱甘肽(GSH)和（G）丙二醛(MDA)的水平。数据显示为平均值±SEM（n=8）。#P＜0.05，###P＜0.01，###P＜0.001；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
3. HGWD改善DPN小鼠血脂水平
鉴于2型DPN的血脂水平与DPN密切相关，我们检测血浆TG、HDL-C、T-CHO和LDL-C水平以评估血脂。如图2A–D所示，DPN小鼠的TG、T-CHO和LDL-C水平呈上升趋势，HDL-C水平呈下降趋势。上述指标在HGWD处理的小鼠中均得到缓解。
图3 HGWD改善了炎症反应和神经生长因子的水平。小鼠血浆中（A）TNF-α、（B）IL-1β、（C）IL-6、（D）IL-10、（E）神经营养因子(NT-3)和（F）神经生长因子(NGF)的水平。数据显示为平均值±SEM（n=8）。#P＜0.05，###P＜0.01，###P＜0.001；*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。
4. HGWD增强DPN小鼠抗氧化能力
高葡萄糖浓度水平在DPN中的作用可以触发氧化应激。我们测定SOD、GSH和MDA以评估氧化应激水平。如图2E–G所示，HGWD增加了DPN小鼠血浆中的GSH水平和SOD活性，同时降低了MDA水平。
图4 各组的多变量分析。（A）QC、对照、DPN和HGWD处理组的PCA分析；（B）对照组、DPN组和HGWD处理组的PLS-DA分析；（C）对照组和DPN组的OPLS-DA分析；（D）DPN和HGWD处理组的OPLS-DA分析；（E）C的OPLS-DA模型的置换检验；（F）D的OPLS-DA模型的置换检验。（1）：正离子模式和（2）：负离子模式。（n＝8）。
5. HGWD可减轻炎症反应，提高神经生长因子水平
考虑到炎症与DPN之间的密切联系，我们通过ELISA测试了HGWD对炎症的调节作用。如图3A–D所示，HGWD降低了DPN小鼠血浆中的TNF-α、IL-1β和IL-6水平，同时提高了IL-10水平。
低水平的神经生长因子会诱发DPN。我们检测了HGWD对NT-3和NGF水平的影响，并检测到与DPN小鼠相比，HGWD小鼠中这两种指标的水平增加（图3E-F）。
表1 各组的差异代谢产物
6. HGWD逆转改变DPN小鼠的血浆代谢谱
6.1 多元分析
为了探讨HGWD干预DPN的机制，我们比较了对照组、DPN组和HGWD处理组的血浆代谢谱差异。所有上述组的总离子色谱图如补充材料图S2所示。如图4A所示，我们在QC和上述三组中进行了主成分(PCA)分析，表明对照组、DPN组和HGWD处理组的内源性代谢物发生了显著变化。此外，由于共洗脱代谢物数据的有效性对于确保半定量评估具有重要意义，因此我们分析了QC样品中共洗脱代谢物1-13的变异性。我们分析了代谢物1-13峰面积的变异系数（CV），并观察到这些代谢物的变异系数小于5%（补充材料表S1），表明这些共洗脱的代谢物在本研究中是有效的。同时，QC样品紧密聚集在一起，表明LC-MS系统的稳定性令人满意。我们采用PLS-DA来评估这些研究组在降维条件下代谢谱的差异，这为这三组之间的差异提供了额外的证据（图4B）。此外，我们还进行了OPLS-DA，以探讨两个研究组之间的显著差异。如图4C–D所示，DPN组与对照组有显著差异，HGWD处理组与DPN组明显分离。我们使用置换检验（200次）来验证OPLS-DA模型的适用性和有效性（图4E–F）。
图5 （A）潜在生物标志物的热图分析；（B）DPN和对照组血浆代谢产物的通路分析，（C）HGWD处理组和DPN组血浆代谢产物的通路分析。
6.2 潜在标志物
如表1所示，37种代谢产物在对照组、DPN组和HGWD处理组之间存在显著差异（VIP>1，P<0.05）。血浆代谢物的鉴定列于补充材料中。同时，热图显示了这三组潜在生物标志物相对浓度的差异（图5A）。
6.3 代谢通路分析
我们通过MetaboAnalyst 5.0分析了37种代谢产物的代谢途径。结果显示了一些对DPN和对照组有影响的途径。前六位包括鞘脂代谢、不饱和脂肪酸生物合成、氨基酰tRNA生物合成、花生四烯酸代谢、氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）生物合成以及牛磺酸和亚牛磺酸代谢（图5B）。与DPN组相比，HGWD处理后富集了四条途径，如鞘脂代谢、不饱和脂肪酸生物合成、花生四烯酸代谢、氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）生物合成（图5C）。
图6 HGWD改善DPN小鼠肠道微生物群的微生态失调。（A）Chao1指数。（B）Shannon指数。（C）Simpson指数。（D）主成分分析。（E）PCoA。（F）NMDS。（G）通过LEfSe分析获得的分支图。（H）主要生物标志物分类群的LDA效应大小分析。
7. HGWD改善DPN小鼠的肠道菌群紊乱
我们对新鲜粪便进行16S rRNA基因测序分析，以评估各种处理对DPN肠道微生物群失调的影响。根据α多样性指数（图6A–C），与对照小鼠相比，DPN小鼠的Chao1指数显著增加，Shannon和Simpson指数显著下降，表明在DPN条件下，微生物丰度增加，微生物多样性降低。HGWD逆转了上述三项指标，显示了HGWD对DPN小鼠的疗效。β多样性距离测定是为了研究肠道微生物群在样本之间的结构变化。如图6D-F所示，对照和DPN小鼠的微生物群落明显不同。然而，HGWD逆转了这一现象。LEfSe分析确定了所有组中的优势细菌。根据相对丰度，分支图中显示了肠道菌群的生物标志物（图6G）和线性判别分析（LDA）值分布直方图（图6H）。其中毛螺菌科、罗氏菌、梭菌、Anaerotruncus为对照组的肠道微生物标志菌群，DPN组标志菌群为嗜黏蛋白阿克曼菌、Verrucomirobiales、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、Candidatus_Gastraneophilales、Clostridiales_bacterium、Alistipes_obesi、Desulfovibrio、Anaerotruncus、Odoribacter、Mariniplaceae，HGWD处理组为Rikenella、Lactobacillus_interstinalis、Alistipes_inops、Bacteroide_co-ocola、Burkholderiales_bacterium。
我们分析了几个显著差异的细菌门，发现DPN组中拟杆菌门的相对丰度降低，而疣微菌门和Desulfobacterota增加，HGWD处理组逆转了这种变化（补充材料图S3）。此外属水平特异性分析揭示了相对丰度前50的菌属，突出显示DPN组中有17个属发生了显著变化，其中12个属被HGWD逆转（图7A–B），如乳杆菌、拟普雷沃氏菌、拟杆菌显著增加，但Lachnoclostridium、Flavonifractor、Esherichia Shigela、Desulfovibrio、瘤胃球菌、Blautia、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、阿克曼菌、Caprociproducens减少。
为了证明肠道微生物群与DPN发病机制之间的相关性，我们进一步评估了逆转的微生物与一些与DPN相关的生化指标水平（如血脂、氧化应激和炎症反应）之间的Spearman相关性。如图7C所示，DPN相关表型与乳杆菌、拟普雷沃氏菌和拟杆菌呈负相关，与Caproiproducens、Desulfovibrio、Escherichia-Shigella、Lachnoclostridium、[Eubacterium]_coprostanoligenes_group、阿克曼菌呈正相关。因此，我们认为这9种细菌与HGWD治疗DPN的疗效高度相关。
图7 HGWD改善DPN小鼠的肠道菌群紊乱。（A）与对照组相比，微生物群发生显著变化的属。（B）与DPN组相比，微生物群发生显著变化的属。（C）DPN相关指数和差异菌群之间Spearman相关性的热图（*FDR＜0.05，**FDR＜0.01）。
8. 微生物组学和代谢组学的综合分析
为了估计代谢产物与微生物群的相互作用，我们分析了9种关键菌和代谢组学研究中鞘脂代谢、不饱和脂肪酸生物合成、花生四烯酸代谢、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸生物合成相关的15种代谢物。Spearman的相关性分析针对9种细菌和15种代谢产物进行，HGWD处理后，这些细菌和代谢产物的丰度显著逆转。如图8所示，大多数血浆代谢物和肠道细菌之间存在显著相关性。其中，乳杆菌、拟普雷沃氏菌和拟杆菌与L-异亮氨酸、L-亮氨酸、二十二碳六烯酸、二十碳五烯酸呈正相关，与其他11种代谢产物呈负相关。与此同时，Desulfovibio呈现出相反的趋势。这一结果表明，4种细菌（乳杆菌、拟普雷沃氏菌、拟杆菌和Desulfovibrio）与4种途径（鞘脂代谢、不饱和脂肪酸生物合成、花生四烯酸代谢和氨基酸生物合成（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸））的相互作用可能是HGWD干预DPN的重要机制。
图8 细菌和代谢产物之间Spearman相关性的热图。（*FDR＜0.05，**FDR＜0.01）。红色方块表示正相关，而蓝色方块表示负相关。
讨论
DPN是糖尿病最常见和最严重的长期并发症，影响约50-90%的糖尿病患者。由于DPN发病机制复杂，目前尚无有效的治疗方法。
HGWD是《金匮要略》中的经典中草药配方，已在临床上用于改善DPN。然而，关于HGWD对DPN的干预，目前已有系统的实验室研究。因此，我们的研究从体重、FBG、触觉敏感性、热敏性、神经传导速度、外周神经结构、血脂、氧化应激、炎症反应和神经生长因子水平等方面系统地研究了HGWD对DPN小鼠的影响。同时，我们利用血浆代谢组学和肠道微生物组分析了HGWD干预DPN小鼠的机制。
DPN在两种类型的糖尿病中的发病率均为10-50%。尽管慢性高血糖是DPN进展的重要风险因素，但血糖控制似乎仅对1型糖尿病（T1DM）患者有效。它不能在2型糖尿病（T2DM）患者中获得同样的效果。本研究使用db/db小鼠在16周龄时构建自发性DPN小鼠模型，这是一种广泛用于糖尿病并发症的模型。Db/db小鼠是高度近交系的，对瘦素受体没有反应，在五周大时出现高胰岛素血症和高血糖。在16周龄时，db/db小鼠表现出典型的DPN表型，具有较低的热敏感性、触觉敏感性和神经传导速度。服用HGWD后，上述指标均发生逆转，说明HGWD对DPN有干预作用。此外，HGWD对坐骨神经和IENF表现出修复/保护作用，改善血浆中的血脂、氧化应激、炎症反应和神经生长因子水平。这一结果表明，HGWD可能具有同时降低血脂、抗氧化、抗炎和促进神经修复/生长的药理活性。
根据代谢组学研究，鞘脂代谢是与HGWD机制相关程度最高的途径，在HGWD处理的小鼠中，sphinganine、鞘氨醇1-磷酸、植物鞘氨醇、sphinganine 1-磷酸和GlcCr（d18:1/16:0）的减少显示出这一点。近年来，鞘脂代谢被认为是促进各种疾病发展的重要细胞信号因子。这一发现表明，生物活性鞘脂，如鞘氨醇-1-磷酸促进DPN的发展。1-磷酸鞘氨醇（S1P）属于溶血磷脂，可被鞘氨醇中的鞘氨醇激酶（SphK）催化，参与多种信号转导途径，并通过S1P受体（S1PR）调节血管通透性、成纤维细胞迁移、肌成纤维细胞分化和上皮细胞凋亡等多种细胞功能。溶血磷脂信号传导似乎具有广泛的生理和病理生理功能，在胚胎发育过程中发挥着重要作用，尤其是在神经系统发育中。先前的一项研究表明，S1P通过S1PR3和RhoA/ROCK信号通路诱导运动和感觉神经元细胞轴突回缩。本研究发现，HGWD可能通过调节鞘脂代谢来减轻外周神经损伤，促进神经修复。
一些研究人员指出，肠道微生物群和大脑之间的串扰可能会影响神经功能障碍。此外，肠道微生物群及其生物活性代谢产物已被认为可调节宿主生物能量和炎症，这可能是DPN的一种新的机制途径。16S rRNA测序被用于评估不同处理对小鼠肠道菌群微生态失调的影响。同时，结合血浆代谢组学结果，我们发现DPN小鼠中乳杆菌、拟普雷沃氏菌和拟杆菌的丰度降低，Desulfovibio增加，但HGWD处理逆转了这种情况。拟杆菌似乎在人类的免疫调节中发挥着至关重要的作用，表达各种荚膜多糖。其中，荚膜多糖A（PSA）的免疫调节作用受到广泛关注。PSA的有益作用主要包括稳态、促进免疫系统发育以及预防病毒和细菌感染。拟普雷沃氏菌是一种产生短链脂肪酸（SCFA）的菌群，其丰度与代谢综合征呈负相关。SCFA产生菌的富集通过调节宿主免疫和肠道炎症、影响能量代谢和胰岛素敏感性来抑制疾病进展。
Desulfovibrio是人类结肠中硫酸盐还原菌的优势菌，可促进IL-6和IL-8等炎症因子的分泌并诱导炎症反应，这可能与T2DM的慢性低度炎症有关。同时，一些研究发现，高热量饮食的小鼠肠道中Desulfovibrio含量增加。HGWD处理下调了Desulfovibrio的丰度，这可能有助于恢复更健康的肠道微生物群组成，减轻微生态失调和炎症，并可能减轻DPN的外周神经损伤。
乳杆菌已被广泛认为可以改善肠道屏障和紧密连接的完整性，并可提供防止肠上皮屏障渗漏的保护。乳杆菌丰度的降低可能会破坏肠道屏障，导致肠道通透性增加，有害物质转移到系统循环中，加剧炎症和氧化应激，从而导致外周神经损伤。通过给予乳杆菌或粪便移植来调节肠道微生物群可以改善胰岛素抵抗。在目前的研究中，HGWD处理增加了乳杆菌的丰度，乳杆菌产生各种代谢产物，如SCFAs，具有抗炎和神经保护特性。这些代谢产物可以调节免疫反应，减少氧化应激，并影响神经元功能。
微生物组和代谢组学的综合分析表明，乳杆菌、拟普雷沃氏菌和拟杆菌与鞘脂代谢显著相关。最近的研究表明，肠道微生物群可能会影响宿主的鞘脂代谢。我们的研究表明，HGWD可能通过调节这些肠道微生物群来调节鞘脂代谢从而减轻DPN，需要更深入的研究来阐明其具体机制并确定其临床意义。
结论
本研究表明，HGWD可改善db/db小鼠的DPN。血浆代谢组学和肠道微生物组分析确定，4种细菌（乳杆菌、拟普雷沃氏菌、拟杆菌和Desulfovibrio）和4种途径（鞘脂代谢、不饱和脂肪酸生物合成、花生四烯酸代谢和氨基酸生物合成）的相互作用是HGWD干预DPN的关键机制。本研究提供了一种整合血浆代谢组学和肠道微生物组的新方法，以评估HGWD干预DPN的药效学和机制。为今后治疗DPN的中药发现研究提供了有价值的依据。
原文链接：
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/37820997/
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