导读
在中医学中，胆汁淤积性肝病属于黄疸。茵陈术附汤
4-dihydroxychollidine（DDC）诱导的慢性胆汁淤积小鼠模型，研究YCZFD的作用；然后用代谢组学方法研究YCZFD对代谢产物的影响；采用液相色谱-三重四重质谱法（LC-MS/MS）测定血清和肝胆汁酸（BAs）水平，并检测BAs转运蛋白和代谢酶的基因和蛋白质表达。此外，我们还对YCZFD的多种成分的药代动力学进行了探索，以阐明潜在的有效成分；分别使用三明治培养大鼠肝细胞、AML12细胞和双荧光素酶受体系统分析了YCZFD的吸收成分对BA代谢和转运蛋白功能、炎症以及法尼醇X受体（FXR）和孕烷X受体（PXR）激活的影响。YCZFD可降低慢性胆汁淤积小鼠的肝损伤。血清代谢组学结果表明YCZFD影响的主要途径涉及初级BA生物合成和花生四烯酸代谢。YCZFD上调FXR、PXR和BA外排转运蛋白以及肝组织代谢酶的表达，促进胆汁淤积小鼠的BA排泄和代谢。此外，YCZFD下调toll样受体4（TLR4）/核因子κB（NF-κB）通路基因和蛋白质的表达，降低肝脏炎症。药代动力学研究表明，多种成分表现出不同的药代动力学特性。在YCZFD的吸收成分中，多种成分激活FXR和PXR的转录，调节BA转运蛋白和代谢酶功能，降低TLR4和NF-κB1的基因表达。YCZFD可通过TLR4/NF-κB信号通路促进BA的排泄和代谢，抑制炎症，从而改善CCLI。YCZFD的多种成分可发挥BA稳态调节和抗炎作用，对CCLI具有联合作用。（YCZFD）是治疗黄疸的经典方剂。本研究旨在探讨YCZFD治疗慢性胆汁淤积性肝损伤（CCLI）的潜在机制和有效成分；我们采用3, 5-diethoxycarbonyl-1,
研究热点：
1. YCZFD对慢性胆汁淤积性肝损伤具有深远的保护作用；
2. 代谢组学揭示YCZFD调节胆汁酸和炎症途径；
3. 药代动力学显示YCZFD具有多种潜在的有效成分；
4. 细胞学表明多种成分表现出联合作用。
论文ID
原名：Identifying hepatoprotective mechanism and effective components of Yinchenzhufu decoction in chronic cholestatic liver injury using a comprehensive strategy based on metabolomics, molecular biology, pharmacokinetics, and cytology
译名：基于代谢组学、分子生物学、药代动力学和细胞学的综合策略研究茵陈术附汤对慢性胆汁淤积性肝损伤的肝保护机制和有效成分
期刊：Journal of Ethnopharmacology
IF：5.4
发表时间：2023.09
通讯作者：马越鸣&吴家胜
通讯作者单位：上海中医药大学
实验设计
实验结果
1. YCZFD改善了CCLI
与空白对照组相比，DDC组的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶、碱性磷酸酶、直接胆红素（DBIL）和总胆红素（TBIL）均升高（图3A）。然而，YCZFD处理后，胆汁淤积小鼠的血清ALT、AST、DBIL和TBIL降低。此外，DDC组中出现胆管细胞增殖、肝细胞坏死和炎症浸润（图3B和C）。然而，YCZFD改善了肝脏的这些变化（图3B和C）；这种改善在高剂量YCZFD组中最为明显。
图1 YCZFD治疗慢性胆汁淤积症的疗效评估策略及其各成分的作用机理
图2 YCZFD对DDC致小鼠慢性胆汁淤积性肝损伤的药效学实验设计
2. 血清代谢组学研究
偏最小二乘判别分析（PLS-DA）可以很好地区分三组的整体代谢（图4A）。主成分分析图显示了一种稳定的分析方法，因为QC样品是紧密聚类的（补充图S4A）。OPLS-DA图显示，两组之间的样本是分离的（图S4B–C）。我们使用值（VIP>1）（图S5）、火山图（图4B，倍数变化>2）和Mann-Whitney检验（P<0.05）来寻找对照和DDC组以及DDC和DDC+YCZFD-H组之间的差异代谢物。YCZFD影响的主要途径是初级BA生物合成、花生四烯酸代谢、卟啉和叶绿素、牛磺酸和亚牛磺酸、视黄醇和鞘脂以及精氨酸生物合成途径（图4C）。这些已鉴定代谢物的代谢变化如热图所示（图4D）和补充表S4。
图3 YCZFD减轻DDC诱导的小鼠慢性胆汁淤积性肝损伤
（A）血清ALT、AST、ALP、TBIL和DBIL水平。（B）各组肝组织坏死评分。（C）苏木精和伊红（H&E）染色用于肝脏形态的光学显微镜分析。a：对照；b：YCZFD-H；c：DDC；d：DDC+YCZFD-L；e：DDC+YCZFD-M；f：DDC+YCZFD-H；原始放大倍数×200；数据表示为平均值±标准差（n=10）。与DDC组相比，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
3. YCZFD可改善胆汁淤积小鼠体内BA紊乱
标准品和样品的代表性色谱图如补充图S6–S8所示。与对照组相比，DDC组血清样品中非结合BA（un-BA）、牛磺酸结合BA（Tau-BA）、甘氨酸结合BA（Gly-BA）和总BA的积累增加；然而，用YCZFD处理后，Tau-BA、Gly-BA和总BA降低（图5A）。DDC组除石胆酸外，多种BA显著增加。然而，YCZFD处理后，猪去氧胆酸（HDCA）、α-鼠胆酸、T-ω-鼠胆酸、牛磺酸、牛磺脱氧胆酸和甘胆酸（GCA）显著降低（图5C）。DDC组肝组织除CA和TDCA外，其余BAs均增加；相反，用YCZFD处理后，肝组织中的Tau-BA、Gly-BA、un-BA、总BA、熊去氧胆酸（UDCA）、HDCA、DCA、T-ω-鼠胆酸和GCA降低（图5B和D）。
图4 YCZFD对DDC诱导的慢性胆汁淤积小鼠血清代谢谱的影响
（A）对照、DDC和DDC+YCZFD组的PLS-DA得分图（ESI+，R2X=0.748，R2Y=0.956，Q2=0.873；ESI-，R2X=0.772，R2Y=0.987，Q2=0.876）。（B）对照与DDC组和DDC与DDC+YCZFD组的火山图（红色：上调的变量；绿色：下调的变量；灰色：没有显著变化的变量）。（C）差异代谢产物的通路分析。（D）差异代谢产物的层次聚类热图（与对照组相比，蓝色表示下调，红色表示上调）。DDC+YCZFD：用高剂量YCZFD（12g生药/kg）处理的DDC诱导的小鼠。
与DDC组相比，YCZFD处理后肝脏FXR和PXR mRNA以及FXR蛋白的表达上调。此外，YCZFD上调了肝组织的BA外排、胆盐输出泵（Bsep）、多药耐药相关蛋白2（Mrp2）和多药耐药相关蛋白3（Mrp3）的mRNA表达。YCZFD进一步上调Cyp3a11、Cyp2b10、Ugt1a1和Ugt2B4mRNA表达（图6）。
图5 YCZFD逆转DDC诱导的小鼠BA稳态紊乱
血清（A）和肝脏（B）中非结合胆汁酸、甘氨酸结合胆汁酸、牛磺酸结合胆汁酸的浓度以及总BA的总和。血清（C）和肝脏（D）中单个BA的浓度。数据表示为平均值±标准差，n=10。*p<0.05、**p<0.01。DDC+YCZFD：用高剂量YCZFD（12g生药/kg）处理的DDC诱导小鼠。
4. YCZFD抑制TLR4/NF-κB通路，减轻慢性胆汁淤积小鼠肝脏炎症
DDC组胆汁淤积小鼠肝组织细胞F4/80+和Ly6G+阳性面积增加；YCZFD降低了变化（图7A–C）。此外，YCZFD下调胆汁淤积小鼠TLR4、TNF-α和白细胞介素-6（IL-6）mRNA表达的增加（图7D）。与mRNA表达一致，YCZFD显著下调胆汁淤积小鼠肝组织中TLR4、Myd88和NF-κB以及下游细胞因子IL-6的蛋白表达增加（图7E和F）。此外，YCZFD治疗降低了肝脏中LPS的水平（图7G）。
图6 YCZFD调节核受体和BA代谢酶/转运蛋白以改善DDC诱导的胆汁淤积小鼠的BA稳态
（A-F）BA代谢酶在各组肝组织中的表达。（G–L）BA转运蛋白在各组肝组织中的表达。（M–N）各组肝组织中核受体mRNA表达。（O）对照、DDC和DDC+YCZFD组肝脏FXR的半定量分析。（P）各组小鼠肝组织FXR的免疫荧光。原始放大倍数×200；数据以平均值±标准差表示（mRNA表达n=4，FXR免疫组织化学n=5）；*p<0.05、**p<0.01。DDC+YCZFD：用高剂量YCZFD（12g生药/kg）处理的DDC诱导小鼠。
5. YCZFD的PK
我们建立了测定小鼠血浆和肝脏中16种YCZFD组分（绿原酸、甘草苷、4-羟基苯乙酮、芒柄花苷、苯甲酰新乌头原碱、滨蒿内酯、甘草素、苯甲酰乌头原碱、肉桂酸、苯甲酰次乌头原碱、甘草酸、茵陈色原酮、芒柄花素、白术内酯III、白术内酯II和甘草次酸）的优化方法（详见补充图S2–S3和表S3，S5–S8）。
多种成分（甘草酸、4-羟基苯乙酮和白术内酯II除外，因为其水平低于定量下限）的血浆浓度-时间（c–t）曲线如图8所示。药代动力学（PK）参数如补充表S9所示。口服YCZFD后，肉桂酸、滨蒿内酯、茵陈色原酮和甘草素被迅速吸收（tmax≤0.083h）；绿原酸、甘草苷、白术内酯III、芒柄花素、芒柄花苷、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱和苯甲酰次乌头原碱具有中等的吸收率（tmax范围为0.25-2h），甘草次酸吸收缓慢（tmax=6h）。甘草次酸的曲线下面积（AUC）0-t最高，其次是肉桂酸、甘草素和白术内酯III，其他成分的AUC0-t小于甘草次酸AUC0-t的1%。大多数成分的消除半衰期（t1/2）小于4小时，甘草次酸、苯甲酰次乌头原碱和肉桂酸的t1/2为4-6小时。
图7 YCZFD通过调节慢性胆汁淤积小鼠的TLR4/Myd88/NF-κB通路改善肝脏炎症
（A–B）免疫组化法检测肝组织中F4/80和Ly6G的表达，原始放大倍数为×100或×200。（C）各组小鼠肝脏样品中F4/80和Ly6G蛋白表达的定量。（D）各组肝组织中TLR4、IL-1β和TNF-α的相对mRNA表达。（E）通过蛋白质印迹检测各组小鼠肝脏样品中TLR4、Myd88、NF-κB、IKKα和IL-6的相对蛋白表达。（F）各组小鼠肝脏样本中TLR4、Myd88、NF-κB、IKKα和IL-6蛋白表达的定量。（G）ELISA法检测各组小鼠肝脏LPS水平。数据以平均值±SD表示（免疫组织化学和ELISA的n=5，mRNA表达的n=4，蛋白质印迹蛋白表达的n=3）。*p<0.05、**p<0.01。DDC+YCZFD：用高剂量YCZFD（12g生药/kg）处理的DDC诱导的小鼠。
多种成分（除了绿原酸、甘草酸、滨蒿内酯、4-羟基苯乙酮和肉桂酸，因为它们的水平低于较低的LLOQ）的肝脏c–t曲线如图9所示。PK参数（补充表S10）显示YCZFD在肝脏中的动力学特征与在血浆中的动力学特性不同。肝脏中的绿原酸、滨蒿内酯和肉桂酸水平低于血浆中的水平；然而，白术内酯II在肝脏中的浓度高于在血浆中的浓度，并且可以获得c–t曲线。肝脏中鉴定成分的tmax与血浆中的成分相似；它们的t1/2显著延长（除了绿原酸）。此外，肝脏中大多数成分的暴露量高于血浆中的暴露量，苯甲酰乌头原碱和甘草素分别达到血浆水平的352倍和73倍。
图8 YCZFD多种成分在小鼠体内的血浆浓度-时间曲线
数据表示为平均值±SD，每个时间点n=5。
6. YCZFD成分激活核受体FXR和PXR
细胞活力结果如补充图S9所示。用于进一步研究的浓度如补充表S11所示。在双荧光素酶报告实验中，GW4064和利福平分别用作FXR和PXR报告系统的阳性对照。此外，滨蒿内酯、苯甲酰次乌头原碱、芒柄花素、甘草次酸、芒柄花苷和肉桂酸可显著激活FXR（图10A）。YCZFD这11个组分几乎都对PXR表现出激动剂作用，除了滨蒿内酯（图10B）。
图9 YCZFD多种成分在小鼠体内的肝脏浓度-时间曲线
数据表示为平均值±SD，每个时间点n=5。
7. YCZFD成分增强了三明治培养原代大鼠肝细胞（SCRH）中BA外排转运体的功能
如图10C所示，使用ANIT诱导SCRH降低了d8-TCA的胆汁排泄指数（BEI）和体外胆汁清除率（Clbiliary）。然而，与滨蒿内酯、苯甲酰乌头原碱、甘草次酸、甘草素和芒柄花苷共同孵育可改善d8-TCA的BEI和Clbiliary，逆转ANIT的抑制作用。结果显示，ANIT降低了5 (and 6)-carboxy-2′,7′-dichloroflourescein（CDF）的BEI和Clbiliary（图10D）。然而，各组成部分的干预产生了显著差异；绿原酸、滨蒿内酯、白术内酯III、甘草次酸、甘草素和肉桂酸改善了CDF的总积累。此外，绿原酸、滨蒿内酯、白术内酯III、苯甲酰新乌头原碱、甘草次酸、甘草素和肉桂酸可增加CDF的BEI和Clbiliary。
图10 YCZFD成分通过核受体FXR/PXR和炎症途径调节胆汁酸的代谢、运输
（A–B）YCZFD组分激活核受体FXR和PXR；将各组与对照组进行比较。（C–D）YCZFD组分促进BA外排转运蛋白Bsep和Mrp2的功能；将各组与ANIT组进行比较。BEI和Clbiliary以对照的百分比表示。（E–F）YCZFD组分促进BA代谢酶Cyp2b1和Ugt1a1的活性；将各组与模型组进行比较。（G–H）TLR4和NF-κB1在TLR4和NFκB-OE-AML12中的表达。数据表示为平均值±标准差，n=3。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
8. YCZFD成分激活SCRH中BA代谢酶
在ANIT存在的情况下，I相代谢酶Cyp2b1和II相代谢酶Ugt1a1的酶活性受到抑制。然而，芒柄花素、甘草次酸和芒柄花苷可以逆转ANIT对Cyp2b1的抑制作用，绿原酸和苯甲酰乌头原碱可以逆转对Ugt1a1的抑制作用。此外，白术内酯III可以逆转这两种酶的活性（图10E和F）。
表1 YCZFD成分的作用总结
9. YCZFD组分在细胞模型中降低TLR4/NF-κB1的表达
结果显示(图10G和H)，与TLR4-CON-AML12/NF-κB-CON-AML12相比，TLR4-OE-AML12和NF-κB-OE-AML12中TLR4和NF-κB1 mRNA表达量升高。用YCZFD组分处理24小时后，滨蒿内酯、芒柄花素、甘草次酸、甘草素和芒柄花苷可显著下调TLR4-OE-AML12中TLR4的mRNA表达。绿原酸、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、芒柄花素、甘草次酸、甘草素、芒柄花苷和肉桂酸抑制NF-κB-OE-AML12中NF-κB1的mRNA表达。
讨论
草药或天然成分对治疗肝病很重要。中医药治疗肝病疗效显著。YCZFD是治疗慢性肝病的经典中药配方。然而，YCZFD对慢性胆汁淤积症的影响在本研究之前尚不清楚。DDC诱导的胆汁淤积小鼠模型是经典的原发性硬化性胆管炎动物模型。我们之前的研究结果发现，在使用DDC处理4周的小鼠中，肝组织有明显的胆管增生、胶原沉积和肝星状细胞活化，这反映了慢性胆汁淤积的状况。因此，在本研究中，我们使用DDC诱导的小鼠模型来研究YCZFD对CCLI的疗效。YCZFD能明显改善慢性胆汁淤积小鼠的血液生化和肝脏组织学损伤。结果表明YCZFD对CCLI具有保护作用。目前，医疗人员缺乏治疗原发性硬化性胆管炎的有效药物。在我们之前的研究中，我们研究了UDCA对DDC诱导的小鼠慢性胆汁淤积性肝损伤的影响，我们的研究结果表明，UDCA对DCC诱导的胆汁淤积性肝脏损伤缺乏保护作用。因此，阳性对照组未纳入本研究。
我们目前的病理学研究结果表明，YCZFD-H是改善DDC诱导的胆汁淤积性肝损伤的最佳治疗剂量。此外，我们之前的研究表明，YCZFD-H是改善胆汁淤积性肝损伤的最佳治疗剂量。因此，我们选择YCZFD-H组来阐明其作用机制。中药配方的作用机制十分复杂。因此，在本研究中，代谢组学首先用于阐明YCZFD可能影响的代谢途径，以阐明潜在的机制。在代谢组学分析中，我们发现YCZFD影响的主要途径包括初级BAs生物合成以及牛磺酸和亚牛磺酸的代谢。由于游离BA与牛磺酸结合形成Tau-BA是II相BA代谢的重要途径，这些结果表明YCZFD可以调节BA代谢途径。此外，对血清和肝脏BA水平的分析表明，YCZFD干预后胆汁淤积小鼠的BA水平降低。BA稳态是由BA相关的核受体、转运蛋白和代谢酶介导的。此外，我们发现YCZFD增加了FXR、PXR、CAR和BA代谢酶和转运蛋白的表达。这些结果表明，YCZFD促进BA代谢和排泄，改善胆汁淤积小鼠体内BA稳态紊乱。
代谢组学分析表明，YCZFD影响的主要途径包括慢性胆汁淤积小鼠的花生四烯酸代谢和鞘脂代谢。花生四烯酸通过环氧合酶代谢为前列腺素和血栓素，或脂氧合酶代谢成白三烯；这些代谢产物作为介质促进炎性细胞因子的产生并调节免疫功能。研究表明，YCZFD给药后，DDC模型小鼠的花生四烯酸相对含量显著降低和增加。YCZFD可降低其下游代谢和炎症介质。此外，在某些情况下，鞘脂可能会引发部分炎症过程。在本研究中，DDC组鞘脂增加，YCZFD治疗后鞘脂减少，这可能与改善炎症反应有关。
代谢组学结果表明，YCZFD对慢性胆汁淤积症的保护作用可能与改善炎症有关。肝脏病理学显示YCZFD减少了炎症细胞的浸润，F4/80和Ly6G免疫组织化学显示YCZFD减少了中性粒细胞和巨噬细胞在肝脏中的浸润。BA稳态失衡可导致肝脏炎症。TLR4主要在单核细胞、巨噬细胞、肝细胞和其他免疫细胞中表达，是炎症反应中的重要受体蛋白。TLR4可被积聚在肝细胞中的肠内毒素LPS或BA激活；它可以通过MyD88依赖性或非依赖性信号通路向下游传递，其中MyD88依赖性信号通路占主导地位。TLR4与细胞质区MyD88的结合进一步激活NF-κB通路。NF-κB激酶激活后，NF-κB被释放到细胞核中，激活靶基因的转录，如IL-1β、IL-6和TNF-α，并导致炎症反应。在本研究中，我们发现YCZFD降低了胆汁淤积小鼠肝组织中LPS的水平，并下调了TLR4、Myd88、NF-κB和下游炎症因子的表达。这些结果表明，YCZFD可以通过调节TLR4/Myd88/NF-κB通路来抑制炎症并改善肝损伤。
尽管YCZFD在临床上已经使用了数百年，但在本研究之前，其有效成分尚未确定。在大多数中药配方中，潜在有效成分通常被吸收到血液中并达到有效浓度。因此，了解多种成分的药代动力学特征对于研究中药配方中潜在的有效成分至关重要。在本研究中，我们首先优化了先前建立的大鼠血浆中YCZFD多组分的LC-MS/MS分析方法，并探索了更灵敏的方法来量化小鼠血浆和肝脏样品中吸收更多的成分。此外，在DDC诱导的胆汁淤积小鼠的血浆和肝脏中，更多YCZFD成分的PK特性得到了阐明。我们发现这些成分表现出不同的PK特征。肉桂酸、滨蒿内酯、甘草素等成分吸收迅速；当需要速效时，这是有益的。然而，其中一种成分甘草次酸的吸收相对较慢。此外，肝脏中大多数成分的浓度高于血浆中的浓度。一些成分从血浆中迅速消除，而一些成分则相对缓慢地消除。这些PK特征可能有利于YCZFD的整体效果。PK结果提供了有关潜在有效成分的信息。由于并非所有从中药配方吸收到血液中的成分都可能有效，因此应通过疗效研究来验证潜在有效成分。另外根据肝脏和血浆中大多数成分的暴露水平，我们采用YCZFD中10种成分（药材代表性成分或有效成分），即绿原酸、滨蒿内酯、白术内酯III、苯甲酰乌头原碱、苯甲酰新乌头原碱、芒柄花素、甘草次酸、甘草素、芒柄花苷、肉桂酸，探讨其体外调节BA和炎症的作用。
在上述动物研究中，YCZFD通过上调DDC诱导的胆汁淤积小鼠的BA代谢酶和外排转运体来改善紊乱的BA稳态。三明治培养原代小鼠肝细胞模型和DDC诱导的SCRH模型在初步试验中不稳定。因此，我们采用以胆汁外排受损为特征的ANI诱导SCRH模型，研究YCZFD成分对代谢同工酶和外排转运体功能的影响。在该模型中，BEI表示胆管中BA占细胞和胆管中总BA的比例，描述了外排转运蛋白的活性。Clbiliary率表示细胞的BA清除速度，即底物从基底外侧进入胆汁的胆汁清除率。BEI和Clbiliary率的增加表明外排转运体的功能增强，可以有效地将底物转运到胆汁中。d8-TCA是BAs转运蛋白的底物，可通过Ntcp被肝细胞摄取，并通过Bsep释放到胆管。ANIT的诱导导致肝细胞中d8-TCA的积累减少，这与Ntcp的抑制有关。而且ANIT处理的SCRH中d8-TCA的BEI和Clbiliary率显著下降，表明Bsep障碍和细胞内胆汁淤积。在本研究中，我们发现一些成分促进了Bsep的功能，并逆转了ANIT诱导的SCRH中d8-TCA的细胞内胆汁淤积。5 (and 6)-carboxy-2′,7′-dichloroflourescein diacetate（CDFDA）通过被动扩散进入细胞内，被细胞内酯酶裂解形成具有荧光特性的CDF。CDF主要通过Mrp2排出到胆管，并通过Mrp3返回到基底外侧。ANIT处理不影响细胞和胆管中总CDF的积累，表明ANIT不影响Mrp3。在这种情况下，BEI和Clbiliary率仅反映了外排转运体Mrp2的效率。在研究中，我们还发现一些成分改善了Mrp2功能紊乱，并逆转了ANIT诱导的CDF细胞内胆汁淤积。此外，在ANIT诱导的SCRH模型中，我们使用Cyp2b1和Ugt1a1作为代表来研究这些成分对BA I相和II相代谢酶活性的影响。ANIT诱导导致Cyp2b1和Ugt1a1的酶活性受到抑制。我们还发现，一些单独的成分显著改善了ANIT诱导的Cyp2b1和Ugt1a1酶活性的降低。表1总结了影响BA代谢同工酶和外排转运体功能的YCZFD成分。
在这项动物研究中，YCZFD可以通过调节TLR4/Myd88/NF-κB通路来抑制炎症并改善肝损伤。因此在体外抗炎研究中，我们采用TLR4-和NF-κB-过表达细胞系(TLR4-OE-AML12和NF-κB-OE-AML12)观察YCZFD各组分对TLR4-和NF-κB表达的影响。我们发现一些成分抑制了TLR4/NF-κB-OE-AML12细胞中TLR4和NF-κB1的mRNA表达。影响TLR4/NF-κB途径的YCZFD成分总结于表1中。在动物研究中，YCZFD上调了FXR和PXR的表达。FXR和PXR是调节BA代谢和运输以及炎症途径的重要核受体。因此，我们使用FXR和PXR的双荧光素酶测定来观察YCZFD组分对FXR和PXR激活的影响。我们发现大多数成分都能显著激活FXR和PXR基因。表1总结了激活FXR和PXR的YCZFD成分。
所有的体外结果表明，多种YCZFD成分可以作用于BA稳态调节和抗炎的不同机制或环节，并在CCLI中表现出联合作用。在本研究中，尽管我们对YCZFD在CCLI中的作用机制和作用成分进行了系统的研究，但由于中药配方的复杂性，还存在其他机制、干姜成分的作用以及其他难以分离的成分等问题需要进一步研究。代谢组学分析表明，YCZFD影响的主要途径还包括卟啉和叶绿素代谢。DDC诱导的卟啉在肝脏中积聚具有胆管细胞毒性，可形成卟啉栓塞，阻断小胆管并诱导胆汁淤积。此外，随着DDC暴露时间的延长，小鼠出现显著的胆管反应、门区炎症反应和胆管纤维化。结果表明，YCZFD改善了卟啉代谢紊乱，这可能有助于YCZFD对抗CCLI的作用；然而，其机制需要进一步澄清。此外，肠道微生物群被认为与疾病的发生和发展密切相关。据报道，BA与肠道微生物群有相互作用；然而，YCZFD对肠道微生物群的影响尚不清楚，需要进一步研究。
结论
YCZFD对CCLI具有显著保护作用，其机制可能涉及改善胆汁淤积小鼠BA稳态紊乱、抑制TLR4/NF-κB通路和改善肝脏炎症。YCZFD的多种成分可能作用于BA稳态调节和抗炎的不同机制或环节，表现出对CCLI的联合作用。我们的研究结果阐明了YCZFD治疗阴黄证的科学内涵，并将促进其在慢性胆汁淤积症治疗中的应用。此外，本研究阐明的作用机制和有效成分将有助于YCZFD将来被进一步用于治疗慢性胆汁淤积性肝病。
原文链接：
https://www.sciencedirect.com/science/article/abs/pii/S0378874123009285
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