以下文章来源于生物工程学报 ，作者程峰等
论文概览
标题
多聚磷酸激酶及其在ATP再生体系构建中的进展
作者
程峰1,2，李欢1,2，李可欣1,2，刘海云1,2，沈其1,2，薛亚平1,2*，郑裕国1,2
1 浙江工业大学 生物有机合成技术研究浙江省重点实验室
2 浙江工业大学 手性生物制造国家地方联合工程研究中心
摘要：构建高效的腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)再生体系可显著提高生物催化磷酸基团转移反应的效率。多聚磷酸激酶(poly phosphate kinase, PPK)能利用来源广、廉价且稳定的多聚磷酸(polyphosphate, Poly P)盐作为磷酸基供体，能够实现单磷酸腺苷(adenosine monophosphate, AMP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)、ATP、Poly P之间磷酸基的高效定向转移，已成为构建ATP再生体系的首选。本文介绍了不同类型PPK的结构特征、相关催化机制以及不同来源的PPK在酶活、催化效率、稳定性和底物偏好性的特征差异；归纳和列举了针对野生PPK酶学性质不足进行分子改造的实例，并对PPK在ATP再生体系构建的研究进展进行了总结。
腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate, ATP)是一种高能磷酸化合物，其作为磷酸基团供体在工业上参与合成众多含磷酸重要化合物。但在生物合成中，若使用与底物等化学计量(甚至几倍于底物)的ATP作为原料则会大大增加生产成本，这是限制ATP作为磷酸基团供体工业化应用的主要瓶颈。多聚磷酸激酶(poly phosphate kinase, PPK)能够以多磷酸盐(polyphosphate, Poly P)作为磷酸盐供体，进行ATP的合成再生反应[1]，相较于其他ATP再生系统，如醋酸激酶-乙酰磷酸[2]、丙酮酸激酶-磷酸烯醇式丙酮酸[3]和肌酸激酶-磷酸肌酸[4]系统，所需的底物廉价且稳定，更适用于工业放大。选择采用PPK介导的ATP再生体系与主产物生产酶进行级联的方法(图1)，共同进行生物催化反应，在很大程度上可以降低原料成本。
图1 多聚磷酸激酶PPK介导的ATP再生体系
因此，多聚磷酸激酶PPK介导ATP再生在工业应用上具有重要意义。本文从以下几个方面展开：不同类型PPK的分类、PPK1与PPK2的特征性结构、生物催化机制以及利用PPK实现ATP再生系统的典型示例(图2)，并对未来工业化利用PPK的发展方向进行展望，为进一步创制活力高、稳定性强的PPK，开发效率高的ATP再生体系提供理论指导。
图2 本文主要内容示意图 示意图包括PPK酶的分类、结构、生物催化过程以及ATP再生体系构建
1 多聚磷酸激酶(PPK)
1.1 PPK概述
PPK (EC2.7.4.1)主要分为PPK1和PPK2两大家族，催化ATP或GTP的γ磷酰基可逆地转移到Poly P，最早发现的PPK其系统命名为ATP-多聚磷酸转移酶(ATP-poly phosphate phosphotransferase)，属于PPK1家族，能够催化以ATP和Poly Pn为底物生成二磷酸腺苷(adenosine diphosphate, ADP)和Poly Pn+1的可逆反应，其天然活力在许多病原体的基本代谢和毒力中具有重要作用[3]。虽然PPK1和PPK2这2个酶家族都能够催化合成Poly P，但PPK1优先从三磷酸核苷合成Poly P，而PPK2优先利用一磷酸核苷或二磷酸核苷[4]。Achbergerová等分析比较大肠杆菌(Escherichia coli) PPK1的109个序列同源物和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PPK2的109个序列同源物的系统发育，证实了PPK1与PPK2的氨基酸序列相似度低，且PPK2的产生比PPK1早[5-6]。黄金玲等[7]证实PPK1和PPK2对鸟苷酸和腺苷酸的选择性不同：PPK2可同等程度地转化GTP和ATP合成Poly P；而PPK1只能以ATP为底物合成Poly P，PPK2能够利用Poly P合成GTP或ATP，且利用Poly P合成GTP的能力是合成ATP的30多倍。
与PPK1相比，PPK2可将Poly P作为供体实现GDP磷酸化为GTP[8]。同时PPK2生成ATP/GTP的速度是其逆反应的75倍，远高于PPK1。如图3所示，与PPK1相比，PPK2将短链Poly P作为底物，主要应用于Poly P的分解代谢[7]；当Poly P的含量足够时，Poly P间可发生齐聚反应使生物体内的PPK2表观活性提高10倍，故PPK2激酶可用于开发核苷酸的Poly P依赖的ATP再生系统，并被用于各种需要ATP参与的催化反应[9-10]。
图3 PPK1与PPK2的反应示意图
PPK2与PPK1的序列相似度低且各自高度保守。PPK2家族按照PPK2的序列功能特征和发育分析可将其分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ这3个亚型[11](图4)。PPK2-Ⅰ型主要催化ADP磷酸化为ATP[12]，PPK2-Ⅱ型偏好催化AMP磷酸化为ADP[13]，而PPK2-Ⅲ型对ADP和AMP这2种底物均有活性[14]，同时可以实现从AMP到ADP的磷酸化和ADP到ATP的磷酸化[15]，是一种双功能生物催化剂[14]。根据Ogawa等[16]的最新研究，PPK2-Ⅲ有可能连续利用Poly P，同时转移多个Pi基团，使相当一部分的AMP通过焦磷酸化产生ATP。因此，PPK2-Ⅲ有替代Ⅰ型和Ⅱ型用于生物催化再生ATP的潜力。还有一小部分PPKs，只能进行嘧啶核酸基的磷酸化，被命名为PPK3，但目前在系统发育上仍归类于PPK2家族[17]。
1.2 多聚磷酸激酶的序列、结构特性分析
目前已知PPK酶的类型主要有PPK1和PPK2两种，其不同之处在于PPK2的一级氨基酸序列仅约为PPK1氨基酸序列长度的一半，且2种PPK的氨基酸序列无相关性。尽管PPK1和PPK2之间缺乏同源性，但两类酶在整个细菌界都是高度保守的[18-19]。
PPK1是具有4个结构域(N结构域、H结构域和两个C结构域)的约80 kDa的蛋白[20]。这4个结构域分别为氨基末端(N)结构域、头部(H)结 构域和两个密切相关的羧基末端(C1和C2)结构域[15]。N结构域位于C-末端结构域的上表面，为ATP的腺嘌呤环提供结合界面，而H结构域参与二聚化。PPK1的2个C结构域在结构上类似于磷脂酶D的催化结构域，而C1结构域包含一个自磷酸化的组氨酸位点(图5)。来源于大肠杆菌(Escherichia coli)的PPK (EcPPK1)通常被认为是PPK1的模式酶，在溶液中呈四聚体，单体分子量约为80 kDa[20]。它是第一个经过纯化和生物化学表征的PPK[21]，其三维结构也已解析[18]。大肠杆菌的EcPPK1结构分析显示其是具有4个结构域的二聚体，活性位点位于一个ATP结合口袋的结构通道内，Poly P的迁移受到该通道的影响。结合口袋有可能是PPK抑制因子的靶位点，一旦抑制因子与结合口袋结合就会破坏PPK二聚体结构致使PPK失活[21]。EcPPK1的16个组氨酸残基中，有4个在多种细菌物种中是保守的。将这4个组氨酸进行突变，其中His-430和His-598突变为谷氨酰胺后，EcPPK1功能不受影响，而His-441和His-460突变为谷氨酰胺或丙氨酸，EcPPK1则失去体外合成Poly P或ATP的能力[22]。此外，研究发现来源于PPK1的原核生物盘基网柄菌(Dictyostelium discoideum)的DdPPK具有1 050个氨基酸残基，而大肠杆菌的PPK只有688个氨基酸残基；DdPPK多出的362个氨基酸残基与大肠杆菌的PPK蛋白序列无同源性[23]，可以推断真核生物PPK和原核生物的PPK在蛋白结构上是有显著差异的。
图4 不同种类PPK2的催化示意图[10] PPK2催化合成ATP的优先反应
图5 PPK1的模式酶EcPPK1的结构示意图(PDB 1XDO) 该结构包含4个结构域：两个亚基的N-末端结构域(残基2–106)，红色；头部结构域(残基107–321)，绿色；C-末端结构域C1 (残基322–502)，蓝色；C2结构域(残基503–687)，黄色
PPK2是具有特殊三级结构特征的约40 kDa的蛋白，包括一个α/β/α三明治结构和一个α螺旋盖结构域[8]，其特征也包括2个保守的基因序列(Walker A、Walker B)和一个LID模块[24]。其中Walker A (GXXXXGK)用于结合ATP的β和γ-磷酸；Walker B (DR)上保守的羧酸残基与结合在核苷酸磷酸基上的金属离子配位[24]。LID结构域为Poly P链端提供几个带正电荷的芳香族氨基酸残基与之配位(图6)。来源于苜蓿中华根瘤菌(Ensifer meliloti，曾用名Sinorhizobium meliloti)的PPK (SmPPK2，图6)通常被认为是PPK2的模式酶[25-26]，其单体分子量大约为40 kDa[8]，在溶液中呈二聚体或四聚体[8,26-27]。目前已经公布了多个不同来源的细菌PPK2晶体结构，具有代表性的包括：第I类：苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti, PDB ID: 3CZQ, name: SMc02148)和图拉氏弗朗西斯菌(Francisellat tularensis, PDB ID: 4YEG, Name: DR87_59)；II类：铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) PPK2C/PA3455 (PDB ID: 3CZP, Name: PA3455)；III类：金黄色节杆菌(Arthrobacter aureus, PDB ID: 3RHF, name: AAur_2811)、红毛节杆菌(Meiothermus ruber, PDB ID: 5LC9, name: MrH_2468)、哈氏噬纤维菌(Cytophaga hutchinsonii, PDB ID: 6ANG, name: CHU_0107)和耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans, PDB ID: 6AQE, name: DR_0132)。结合以上7种细菌的PPK2晶体结构，构建含PPK2的第I、II、III类蛋白质序列(图7)。由比对图可知几株PPK2序列相似度不高，但均具备α/β/α结构，且能观察到明显的Walker A (GXXXXGK)及Walker B (DR)模块。
图6 PPK2的模式酶SmPPK2的结构示意图(PDB 3CZQ) 该结构及其三维蛋白结构与保守序列Walker A (GXXXXGK)、Walker B (DR)和LID模块
1.3 多聚磷酸激酶的催化机理
1.3.1 PPK1自磷酸化的催化机制
Poly P合成的第一步是PPK1的组氨酸残基自磷酸化(图8)，突变研究表明H435和H454可能是PPK的自磷酸化位点[22]。在PPK-AMPPNP晶体结构中，H435从背部位置攻击，直接与AMPPNP γ-磷酸基团相互作用，而H454完全埋在C1-结构域的疏水中心内，这一结果表明，H435是PPK1唯一的自磷酸化位点[18]。
PPK1的H435作为亲核剂攻击ATP的γ-磷酸基团的磷酸二酯键，而H592则起到使β-和 γ-磷酸之间的氧原子质子化的作用(图9)。在C1区和C2区有4个高度保守的氨基酸形成的关键氢键：E623与H435，D470与H592。推测E623在选择H435旋转异构体和降低攻击ATP的pKa方面具有一定的作用。D470的作用可能是结合和正确定位H592。这一模型与以前的生化研究结果一致，即突变体H435Q和H592Q未能自动磷酸化[18]。
图7 PPK2的第I、II、III类蛋白质序列比对 该序列比对涉及PPK2-I：SMc02148和DR87_59；PPK2-II：PA3455；PPK2-III：AAur_2811、MrH_2468、CHU_0107、DR_0132
图8 PPK1催化机理解析 PPK1自磷酸化的机制
图9 PPK1催化机理的应用[10-12] 多聚磷酸激酶(PPK1)的ATP结合位点及其PPK自磷酸化的化学机制(截取文献[18]中的图5部分)
Kumble等[22]的研究表明，在大肠杆菌形成Poly P的过程中，ATP末端磷酸基团先被转移到PPK的组氨酸残基H441和H460上形成一个磷酸酶中间体，随后，在PPK的作用下，使Poly P的链长增加；对H441和H460进行突变后发现突变体蛋白不具有合成Poly P的能力。对变铅青链霉菌(Streptomyces lividans)的组氨酸标签蛋白分析发现其PPK与大肠杆菌的PPK具有相似的酶学特性，所不同的是S. lividans的磷酸酶中间体可能是由ATP末端磷酸基团被转移到保守组氨酸残基H517和H536上而形成的。
1.3.2 PPK2的催化机理
Nocek等对3种不同宿主来源的PPK2 [哈氏噬纤维菌(C. hutchinsonii)CHU_0107、金色节杆菌
(A. aureus)AAur_2811和耐辐射球菌(D. radiodurans)DR_0142]结构进行分析比较[11]，证实PPK2催化AMP、ADP、GMP和GDP的Poly P依赖性磷酸化为相应的核苷二磷酸和三磷酸；并通过活性位点保守序列的分析以及分子间作用力[11]，证明了来自PPK2核心和盖子结构域的几个保守残基的关键作用；提出PPK2将ADP转化为ATP的催化机制，首先由PPK2、Poly Pn、ADP形成三元酶−底物复合物(图10A)，通过桥接Mg2+离子(DR0132中的Mg2+)和几个参与磷酸盐结合、取向、转移和带正电荷的残基来完成匹配(CHU0107中的Lys81、Arg133、Arg208、Lys214和Lys217；DR0132中的Lys70、Arg122、Arg182、Lys188和Lys191)。所有这些残基，以及参与Mg2+配位的2个保守的Asp残基(Asp77和Asp222)，接着由ADP的β-磷酸氧对Poly P末端磷的亲核攻击引发形成过渡态中间体(图10B)；最后形成PPK2、Poly Pn−1、ATP的酶−产物复合物(图10C)。反应最初，Poly P和ADP与2个保守的天冬氨酸(CHU0107中的Asp77和Asp222)紧密结合在活性位点上。此外，Poly P的转移端磷酸化基被2个保守的带正电荷的残基(CHU0107中的Arg208和Lys81)的侧链所稳定。
图10 PPK2s的催化机制：ADP对ATP的多聚磷依赖性磷酸化[11] A：三元酶−底物复合物(PPK2+Poly Pn+ADP). B：过渡态中间体. C：酶−产物复合物(PPK2+Poly Pn−1+ATP)
2 多聚磷酸激酶的分子改造及酶学性质
2.1 多磷酸激酶的分子改造
在工业环境下，野生酶的酶学性质往往需要大幅提升，特别是催化效率、底物选择性、对映选择性和热稳定性等，例如PPK2-Ⅲ类就存在活性低和对ATP催化效率低的问题，通常采用蛋白质工程技术进行分子改造[28]。目前对多聚磷酸激酶的分子改造策略主要有理性设计、半理性设计和定向进化3个策略。理性设计对于酶结构、序列、机制的了解要求较高，目前只有少数研究使用理性设计提高了PPK2的性能[29]。研究发现具有短Poly P使用能力的谷氨酸棒杆菌具有2个PPK基因，PPK2A (对应于NCgl0880)和PPK2B (对应于NCgl2620)，属于PPK2家族[12]，其中PPK2B的过量表达会增加胞内PPK的整体活性及细胞Poly P含量(即谷氨酸棒杆菌的PPK2B在poly P形成方向上的催化效率高于形成ATP的催化效率)。Cao等[29]通过研究发现，短Poly P分子会阻断ADP结合口袋入口的正电荷轨道，并与一个精氨酸(Arg154)相互作用，该精氨酸位于PPK (SMc02148)晶体结构相似的位置。通过该现象，推论并找到了ADP分子在PPK2 (NCg12620)中的替代结合位点(Lys-107、Glu-111和Thr-120)，并将该构型使用到PPK (SMc02148)上(H102K、A106E和V115T)创造了一个替代的ADP结合位点(SMc02148-KET)，其三者动力学参数如表1所示。
相对于理性设计，定向进化不需要详细了解蛋白质结构信息，可以通过易错PCR、DNA重组等手段构建蛋白突变文库后再进行高通量筛选[30]，而半理性设计是目前实验室最常用的技术手段，依赖酶的结构，通过合理分析缩小筛选的范围[31]，选择合适的氨基酸位点进行突变改造[29]。例如PPK2家族的苜蓿中华根瘤菌(SMc02148) (PDB ID: 3CZQ)缺乏利用短链Poly P的能力，而Cao等[29]通过计算模拟和定点突变，设计出的突变体PPK (SMc02148-KET)不仅对ADP形成三磷酸腺苷具有显著的活性，并在ATP再生的级联反应中，获得了高GSH滴度(38.79 mmol/L)和葡萄糖-6-磷酸滴度(87.35 mmol/L)，表明半理性设计的PPK为建立高效ATP再生系统提供了保证。
2.2 金属离子偏好性
2.2.1 金属离子对PPK2-I酶学性质影响
符合PPK2-I类型的酶如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)[26]、结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)[25]显示出Mg2+依赖性，能够利用Poly P生成ATP或GTP[4]。Kornberg实验室将PPK2-I酶从铜绿假单胞菌裂解物中纯化后，对其进行了生化表征。与其他2个铜绿假单胞菌PPK2相比，PPK2-I对二磷酸核苷磷酸化的偏好是Poly P合成的75倍[19]。在核苷二磷酸受体中，GDP比ADP更受青睐，前者的米氏常数较后者大约低2.5倍。在核苷二磷酸方面，在最佳浓度(10 mmol/L)下Mg2+比Mn2+催化效率更高[28]，但在Poly P合成方面却相反，Mn2+将PPK2对Poly P合成速率提高到与PPK1相当的水平[27]。I类谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) PPK2也有类似的现象，添加Mn2+时会表现出最佳的活性，但无论提供什么阳离子，它会优先从ATP/GTP合成Poly P[12]。
表1 PPK (SMc02148, PDB ID：3CZQ)、PPK (NCg12620)和PPK (SMc02148, PDB ID: 3CZQ-KET)的动力学参数[29]
2.2.2 金属离子对PPK2-II酶学性质的影响
PPK2-II催化单磷酸核苷磷酸化，该家族中第一个被发现的成员是来自不动杆菌(Acinetobacter johnsoniii)[13](AjPPK2)的酶，被称为Poly P-AMP磷酸转移酶(Poly P-AMP phosphotransferase, PAP)[17]，能够消耗Poly P也可以从ADP合成Poly P。AjPPK2的Poly P合成动力学参数(Km和kcat)与EcPPK1相似。高浓度(100 mmol/L)的氯化镁有利于Poly P的消耗，而低水平(20 mmol/L)的氯化镁有利于Poly P的合成，再次表明细胞中金属离子可能有助于调节PPK2的反应偏好[32]。AjPPK2后来被证明可以磷酸化GMP和dAMP，但不能磷酸化CMP、UMP或IMP[10]。其辅因子实验中，Mg2+效果最佳，Co2+和Ni2+的活性较弱，而Mn2+和Ca2+没有活性[26]。Sun等[33]筛选到PPK2-I家族中一株来自嗜无机物硫卵菌(Sulfurovum lithotrophicum)的PPK (SlPPK)，在不存在Mg2+的情况下反应几乎没有进行；当Mg2+浓度为 20 mmol/L时达到最佳催化效率，10 mmol/L腺苷的条件下ATP的产率可达76.0%。
2.2.3 金属离子对PPK2-III酶学研究影响
III类PPK2亚家族，能够磷酸化核苷单磷酸或二磷酸(AMP和ADP)。基于对这类新酶的系统发育预测，Motomura等首先验证了来自Meiothermus silvanus、Deinococcus gethermalis、Thermosynechococcus elongatus和Deinococcus radiodurans的PPK2能够利用Poly P从AMP合成ATP[14]。Nocek等[11]新发现的3种II类酶：ChPPK2、DrPPK2和AaPPK2都对Mg2+、Mn2+、Ca2+、Co2+和Ni2+表现出显著的活性，这表明与I类和II类酶相比，PPK2-III似乎可以接受更广泛的金属离子作为辅助因子。
2.3 PPK2的动力学参数
表2概述了已报道的与各种PPK2酶的ATP再生相关的动力学参数[15]。当以ADP为底物时，PPK2-III的kcat比以AMP为底物时要慢，MrPPK和DrPPK的kcatADP值在10−1 s−1范围内。ChPPK和AaPPK对AMP和ADP的催化效率相似，而MrPPK和DrPPK的kcat/KmAXP比kcat/KmADP高两个数量级。因此，ADP的磷酸化可以代表双功能PPKs介导的从AMP产生ATP反应的决定步骤。而PPK2酶在AMP磷酸化的实验中，ATP合成的延迟现象也支持这一结论[34-37]。通过比较不同来源的PPK2能够更有助于理解其是否通过损失活性与催化效率以保持更广泛的底物范围。
表2 PPK2-III的动力学参数[15,33]
3 基于PPK的ATP再生体系构建
3.1 PPK再生ATP的双酶级联生物催化系统
基于PPK的ATP再生体系构建成功与否可根据生物催化的常用衡量标准进行评估[29]，主要的技术经济指标有生物催化剂负载量、生物催化剂配比、底物负载和转化，以及时空产率 [(space-time yield, STY) g/(L.h)]、生产规模等；其次是辅因子的总周转数(total turnover, TTN)，通常认为，辅因子的TTN需要达到102到105。Kameda等[38]利用多磷酸腺苷磷酸转移酶(PAP)和多磷酸激酶(PPK)设计了一种新的ATP再生系统，命名为“PAP-PPK”ATP再生系统。PAP能催化AMP磷酸转化为ADP，PPK催化ADP形成ATP。两种酶都使用无机多磷酸盐Poly P作为磷酸盐供体。在“PAP-PPK”ATP再生系统中，利用Poly P通过PAP和PPK的偶联反应由AMP连续合成ATP，该反应中，ATP再生39.8次，99.5%的CoA转化为乙酰辅酶A。“PAP-PPK”ATP再生系统可以从GMP再生GTP，它也可以用作GTP再生系统。Strohmeier等[35]开发了一种无细胞体系，使用微小栖热菌的MrPPK和苜蓿中华根瘤菌SmPPK利用平均长度超过12的聚磷酸酯链作为供体从AMP生成ATP，并级联羧酸盐还原酶，将不同的芳香族、杂环和脂肪族羧酸在水系中被定量还原成相应的醛。该研究还可以扩展酶法ATP再生系统的应用，另一方面为生物催化合成l-氨基酸等提供有效方法。例如，李元等[36]利用来源于类球红细菌(Rhodobacter sphaeroides)的PPK2构建了共表达ATP再生和l-茶氨酸合成酶的重组大肠杆菌菌株，合成多聚磷酸盐激酶(PPK)和谷氨酰甲胺合成酶(glutamylmethylamine synthetase, GMAS)基因序列，将表达重组质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)中，在37 ℃、pH 7.0条件下，使用5 mmol/L的ATP与200 mmol/L的l-谷氨酸钠反应24 h后，l-茶氨酸的产率可达到86.0%。
3.2 PPK再生ATP的多酶级联生物催化系统
关于体外利用PPK从AMP再生ATP的报道较少，通常为小规模、低底物浓度的研究。Petchey等[34]利用ATP依赖的酰胺键合成酶McbA，通过腺苷酸中间体，可以在水介质中从羧酸和伯胺生物催化合成酰胺。该反应过程中AMP与Poly P作为磷酸供体在AjPPK2-II作用下转化为ADP，SmPPK2-I将ADP转化为ATP以实现能量循环，底物转化率>99%。Winkler小组研究了基于SmPPK与MrPPK联合催化的ATP再生系统的Poly P需求，该系统用于维持羧酸还原酶(carboxylate reductase, CARS)从羧酸中合成醛。研究表明，根据所应用的回收模块，需要大约2倍到6倍的Poly P25 (基于正磷酸盐单元和产品浓度)来推动反应完成[35,37]。Mordhorst等[39]构建了具有ATP再生的酰基辅酶A再生系统，该系统使用廉价的多磷酸盐作为单一能源，约氏曲霉的多磷酸激酶PPK2-II (AjPPK2)用于将AMP磷酸化为ADP，苜蓿中华根瘤菌PPK2-I (SmPPK2)用于ADP磷酸化。再生的ATP可以被羧酸-CoA连接酶用来产生另一种硫酯。在四酶级联中，酰基辅酶A和ATP这两种辅因子，每种可再生2 000次。
Citoler等[40]通过SmPPK将AMP转化为ADP，利用MrPPK将ADP转化为ATP实现ATP循环，并用由羧酸还原酶(CAR)和转氨酶(ω-TA)进行的串联级联来替代传统的脂肪酸胺化。McCAR和Sp-TA在以正庚烷作为溶剂覆盖层的双相系统中已成功与辅因子再循环酶偶联，获得高达96%的底物转化率，实现了碳链长度从C6到C18的饱和及不饱和脂肪酸的胺化。
因此，当使用AjPPK作为冷冻干燥的无细胞提取物从AMP合成ATP时，Poly P浓度增加2.5倍(从200 mmol/L到500 mmol/L)，最终的ATP浓度也会相应增加[41]。而当使用PPK2-III酶作为ATP再生的双功能生物催化剂时，需要过量的多磷酸盐(约5倍的产物浓度)以使反应转化率最大化[41]。PPK2-III酶的系统也适用于短链多磷酸盐的积累和磷酸盐供体的低效使用。例如，使用PURE system™无细胞蛋白质合成系统与来自Cytophaga hutchinsonii的PPK2-III的C末端截短突变体相结合获得的蛋白质产量在Poly P使用后提高了约25%。Sun等[33]构建了从腺苷合成ATP的多酶体系，利用来自拟南芥(Arabidopsis thaliala)的AtAdk在少量ATP作为磷酸盐供体下将腺苷完全转化为AMP，在PPK2-III的LhPPK (Lampropedia hyalina, DSM16112(SHF67157.1))与PPK2-I家族中SlPPK作用下，将反应产生的AMP、ADP转化为ATP，整个体系在腺苷为10 mmol/L的条件下，ATP的转化率可达76.0%。
3.3 Poly P性质对ATP再生体系的影响
在使用PPKs介导的ATP再生体系中，Poly P是目前使用的最主要磷酸盐供体(天然聚合物)，普遍以不同链长的线状和环状磷酸盐形式存在[11,37]。商业上可用的Poly P聚磷酸盐是不同链长聚合物的混合物，具有限定的平均链长，如Poly Pn=25、Poly Pn=45、Poly Pn=65、Poly Pn=100和Poly Pn=700等长链磷酸盐聚合物和焦磷酸盐、三磷酸盐、四磷酸盐等短链磷酸盐聚合物[14,42]。聚磷酸盐不仅可以作为磷酸盐供体，还可以介导一些PPK2在溶液中的寡聚化并促进它们的稳定。链长在10−100之间的线性聚磷酸盐通常是PPK2催化的首选底物[43]。而利用Poly Pn＜5的PPKs极少[43-44]，CgPPK和SmPPK是其中的代表，分子对接研究表明CgPPK可以利用Poly Pn=4是因为PPK亚基之间有一个不寻常的ADP结合位点；而SmPPK对三磷酸盐显示出活性可能是由于ADP隧道入口处与短Poly P结合引起的[24]。
通常来说，增加Poly P的浓度对PPK及消耗ATP的酶表现出抑制作用，例如Poly P可以通过阻断酶的活性部位直接发挥其抑制作用[45]，或通过螯合反应的二价阳离子间接地发挥抑制作用[10,45]。但也有研究表明，有的反应需要较多的Poly P来驱动ATP合成反应的发生，这种对Poly P的低效利用可能是因为部分PPK偏好较长链的聚磷酸盐，这意味着添加的聚磷酸盐中只有一小部分可以作为“活性”磷酸盐供体，短链聚磷酸盐则随着时间的推移而积累。为此，可通过优化Poly P组成、分批补料Poly P和优化镁离子浓度等方法来解决。
3.4 PPK1和PPK2在ATP合成和降解方面的平衡浓度
ATP再生体系构建中，存在ATP及ADP反应的动态平衡。Keppler等[46]在37 ℃、pH 8的条件下，以Poly P为共底物，将EcPPK1和SmPPK2作为模式酶分别与ADP和ATP反应，90 min后达到平衡，延长反应时间不会进一步改变产物浓度。两种反应结果平衡都趋向于70%的ATP和30%的ADP (摩尔比，ADP/ATP=0.43)，反应过程中大约产生5%的AMP。霍乱弧菌(Vibrio cholerae) VcPPK1催化的反应也有类似的平衡浓度(摩尔比，ADP/ATP=0.43)。谷氨酸棒杆菌CgPPK2氨基酸序列虽然是PPK2，但具有PPK1的动力学偏好。在CgPPK2催化的反应中，ADP/ATP的比率(ADP/ATP=35%−40%: 65%−60%) (ADP与ATP为体系1，ADP 35%时ATP 65%；ADP 40%时ATP 60%)，其AMP的生成量比其他PPKs略高，当以ADP为底物时AMP的生成量明显增高。这表明CgPPK2具有明显的肌酸激酶活性，这种PPK2的副反应暂时还无法消除[11,47]。
4 总结与展望
本文介绍了不同类型PPK的结构特征、相关催化机制，以及不同来源的PPK在酶活、催化效率、稳定性和底物偏好性的特征差异，归纳了近些年通过酶分子改造方法提高PPK的稳定性、优化动力学参数、改变辅酶偏好性的研究，为生物催化体系构建ATP再生体系提供了思路和基础。虽然通过蛋白质分子改造PPK后，其酶学性质有所提升，但是目前PPK应用于工业上的实例还比较少。PPK工业化过程指标不仅需要考虑生物催化剂和产品的成本[24]，还需要考察影响其催化过程的其他限制因素(如传质限制)等[10,44]。作为一种常见的ATP再生途径，PPK与需要ATP的酶组成酶联反应体系的前景十分可观，可解决ATP再生系统相关的问题。
通过系统比较不同来源PPK的结构、性质、反应机理等，对PPK的工业化应用基础研究可侧重于以下3个方面：(1) 通过基因组挖掘、宏基因组筛选或蛋白质工程改造等方法筛选出酶活更高的野生型或突变体PPK；(2) 利用蛋白质工程对PPK继续改造，获得稳定性更强、对不同链长Poly P都有良好接受度的PPK；(3) 研究主产物生产酶与PPK偶联后的最适反应条件，根据主产物生产酶的特点匹配PPK，形成工业属性强的生物合成体系，服务于工业生物制造。
转自：“蔻享学术”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
