Chem. Commun. | 铁单原子纳米酶的类双酶活性差异实现区分检测胞内谷胱甘肽

以下文章来源于纳米酶 Nanozymes ，作者纳米酶 Nanozymes

课题背景

作为细胞内最丰富的生物硫醇，谷胱甘肽（GSH）是抵御氧化应激以维持细胞内氧化还原稳态所必需的内源性抗氧化剂比色法。由于成本低廉、操作简单、信号可视化等特点，已广泛用于GSH的检测。目前，已经建立了一些基于纳米酶的比色检测方法。遗憾的是，由于GSH与半胱氨酸（Cys）和高半胱氨酸（Hcy）具有相似的结构和反应活性，大多数基于纳米酶的检测方法难以选择性识别胞内GSH。报道了几种纳米酶传感阵列用于选择性识别GSH，但是它们通常需要合成多个传感元件，并且不同纳米酶之间的相互作用可能降低选择性。因此，迫切需要设计开发一种简单有效的基于纳米酶的传感策略用于区分检测胞内GSH。

近年来，得益于最大的原子利用率、清晰的活性位点和可调的配位环境，单原子纳米酶（SAzymes）表现出优于传统纳米酶的催化活性，具有高的灵敏度。此外，一些SAzymes表现出类多酶活性然而，大多数研究只聚焦于利用SAzymes的某一种类酶活性来提高灵敏度，而忽视了类多酶活性在传感方面的潜在应用。近日，南昌大学黄鹏程、吴芳英团队与安徽师范大学毛俊杰教授合作，通过合理选择共反应剂调节铁单原子纳米酶（Fe-N-C）的类过氧化物酶（POD-like）和类氧化酶（OXD-like）活性，利用两种类酶活性生成活性氧物种（ROS）的差异，巧妙地实现了生物硫醇中GSH的高选择性识别（图1）。

图1. Fe-N-C纳米酶的双酶活性差异对生物硫醇的不同响应

文章内容

首先，通过高温热解包封Fe(acac)3的沸石咪唑酯骨架-8 (Fe/ZIF-8)合成铁单原子纳米酶Fe-N-C，利用多种分析测试手段对其进行了系统表征。结果表明通过自组装和高温热解两步法成功制备了Fe单原子分散的Fe-N-C。值得注意的是，合成的Fe-N-C纳米酶具有与天然酶M-Nx催化位点类似的Fe-N4活性位点(图2)。

图2. Fe-N-C纳米酶的合成及表征

接下来，对Fe-N-C的类酶活性进行了探究。Fe-N-C同时展现出良好的类过氧化物酶和类氧化酶活性。更为重要的是，这两种类酶活性对生物硫醇的响应存在显著差异。实验证明，这种不同的行为主要是因为H2O2或溶解O2被活化时产生了不同的ROS，它们与生物硫醇之间具有不同的反应活性。对于类氧化物酶活性，羟基自由基（OH）是主要的ROS；对于类氧化物酶活性，1O2和O2.-是主要的ROS。由于·OH 的活性极高，不能区分检测各种生物硫醇，而1O2和O2.-的活性相对温和，为选择性检测GSH奠定了基础（图3）。

图3. Fe-N-C的类双酶活性及其对生物硫醇的差异响应

随后，考察了Fe-N-C类氧化物酶活性对GSH的比色传感性能。在最佳条件下，随着GSH浓度的增加，oxTMB的吸收带逐渐下降，溶液颜色由初始的绿色逐渐变为蓝色直至接近无色，这为比色检测GSH提供了直观的依据。在0.05 – 14 µm的浓度范围内，652 nm处吸光度值与GSH存在良好的线性关系，检出限为39.6 nm。鉴于胞内环境的复杂性，选择常见的氨基酸和还原性物质作为干扰物，分析了该方法的选择性。结果表明，氨基酸(包括Cys和Hcy)对Fe-N-C的GSH比色传感并无明显影响，意味着Fe-N-C的类氧化酶活性具有良好的选择性(图4)。

图4. Fe-N-C类氧化物酶活性对GSH的比色传感性能

最后，通过评价细胞样品中GSH水平来检验该方法的适用性。选取小鼠肿瘤细胞系(β-TC-6)和正常细胞系(H9C2)为模型细胞，同时使用GSH检测试剂盒结果进行。两种方法均表明肿瘤细胞(β-TC-6)中GSH总量远高于正常细胞(H9C2)，且两种方法得到的定量结果无显著差异，表明基于Fe-N-C类氧化酶活性的传感平台具有良好的准确性和可靠性。另外，研究了化学物质刺激肿瘤细胞后GSH含量的波动。与GSH检测试剂盒相比，该方法具有特异性强、灵敏度高、线性范围宽、颜色变化丰富和操作简单等优势（图5）。

图5. Fe-N-C类氧化物酶活性用于细胞样品中GSH含量测定

总结

总之，研究者利用生物硫醇对催化活性的抑制作用，放大了Fe-N-C SAzymes类双酶活性的差异，从而实现GSH与其他生物硫醇的高效区分检测，开发的比色传感平台成功用于定量检测细胞内GSH水平及示踪刺激物引起的细胞GSH含量波动。这项工作为利用SAzymes的内在催化特性实现高选择性检测靶标提供了新的视野，将促进SAzymes在生物传感方面的应用。

该工作以"Distinct dual enzyme-like activities of Fe–N–C single-atom nanozymes enable discriminative detection of cellular glutathione"为题发表于 Chemical Communications 。论文第一作者为南昌大学化学化工学院硕士生蔡春祺，通讯作者为南昌大学黄鹏程教授和安徽师范大学毛俊杰教授。

转自：“NANO学术”微信公众号

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