导读
青藤碱（Sinomenine，SIN）是一种从青风藤中分离出的异喹啉类生物碱，是一种用于治疗类风湿关节炎（RA）的中药。临床试验表明，SIN在治疗类风湿性关节炎患者方面具有与甲氨蝶呤相似的疗效，但副作用更少。在本研究中，我们探索了SIN在LPS（lipopolysaccharide，脂多糖）诱导的RAW264.7细胞和胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）小鼠中的抗炎作用和治疗靶点。LPS诱导的RAW264.7细胞分别用SIN（160、320、640µM）预处理；CIA小鼠注射SIN（25、50和100 mg·kg−1·d−1，腹腔注射）30 天。我们首先在经LPS刺激过的RAW264.7细胞中进行了溶剂诱导蛋白沉淀（SIP）实验，发现了SIN与鸟苷酸结合蛋白5 （GBP5）直接结合的明确证据，并得到了分子对接模拟、蛋白质组学和结合亲和力实验（KD = 3.486µM）的支持。更重要的是，SIN处理显著降低了LPS诱导的CIA小鼠RAW264.7细胞和足部组织中GBP5/ P2X7R-NLRP3通路相关蛋白的表达水平。炎症细胞上清液和CIA小鼠血清中IL-1β、IL-18、IL- 6、TNF-α水平均显著降低。本研究阐明了SIN的一种新的抗炎机制：SIN通过竞争性结合GBP5，下调P2X7R蛋白的表达，抑制NLRP3相关通路的活性，最终导致IL-1β和IL-18生成减少。SIN与GBP5的结合特异性及其对GBP5活性的抑制作用表明，SIN有很大的潜力成为GBP5的特异性拮抗剂。
论文ID
原名：Sinomenine ameliorates collagen-induced arthritis in mice by targeting GBP5 and regulating the P2X7 receptor to suppress NLRP3-related signaling pathways
译名：青藤碱通过靶向GBP5及调节P2X7受体抑制NLRP3相关信号通路改善小鼠胶原诱导性关节炎
期刊：Acta Pharmacologica Sinica
IF：8.2
发表时间：2023年7月
通讯作者：刘中秋、卢琳琳、周华和谢莹
通讯作者单位：广州中医药大学和广东省中医院
实验设计
实验结果
1 在LPS诱导的RAW264.7细胞中，采用SIP结合蛋白质组学的方法筛选SIN的潜在靶蛋白
炎症反应是RA的主要病理特征之一，而异常活化的巨噬细胞是RA炎症机制中尤为关键的靶细胞。为了研究SIN在巨噬细胞中直接结合的潜在靶蛋白，我们首先采用SIP实验来检测蛋白的分布。SIP是一种基于能量学的新型蛋白质组学策略，通过定量蛋白质组学来分析药物与靶蛋白之间的相互作用。结果显示，能与SIN结合的蛋白分子量主要在25 kDa ~ 100 kDa之间（图1a）。所鉴定的蛋白在不同阶段都有分子量，且分布均匀（图1b）。主要蛋白分子量分布与SIP实验中分布一致。将LPS、对照和100 μM及10 mM的SIN蛋白进行两两比较。共获得了475种不同的蛋白质（比值小于0.6大于1.5）。其中，LPS与对照组比较得到355个蛋白，100µM SIN与LPS比较得到16个蛋白，10 mM SIN与LPS比较得到89个蛋白，10 mM SIN 与100µM SIN 比较得到15个蛋白（图1c）。差异表达蛋白的KEGG富集分析显示，SIN结合蛋白主要富集于DNA复制、细胞周期、病毒癌变和病毒感染（图2a）。GO分子功能分析表明，这些蛋白的功能主要包括激酶活性、催化活性和连接酶活性（图2b）。
2 确认GBP5蛋白为青藤碱的直接结合靶点
蛋白质组学分析表明，SIN与GBP5蛋白之间可能存在较强的结合。SIN可以结合GBP5的活性口袋，结合能为-7.72 kcal/mol，这也是GDP（GBP5的内源配体）的结合口袋，GDP与GBP5的结合能为-12.5 kcal/mol（图3a, b）。可能与SIN结合的GBP5蛋白的氨基酸包括ASP-182、LEU-245、SER-69、ARG-48、GLY-50、VAL-67、ALA-68和SER-69。为了进一步研究SIN与GBP5的结合，我们首先进行了CETSA（cellular thermal shift assay，细胞热位移分析），即无药物的药物靶向实验。正如预期的那样，CETSA证实了SIN与GBP5结合的可能性，结果表明，SIN使GBP5的Tm50值移动了4.25±0.87℃，并增加了GBP5的热稳定性（图3c），这表明SIN可以直接与GBP5结合。此外，结合亲和试验评估了SIN与hGBP5蛋白之间的结合强度。首先，利用pSmart-I载体在BamHI-XhoI之间插入1 ~ 486氨基酸对应的核酸序列并添加终止密码子进行蛋白质合成（图4a）。SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色结果显示出GBP5蛋白的成功表达（图4b—i）。纯化后的蛋白分子量约为55 kDa，纯度达到95.03%（图4b—ii）。重组蛋白的分子量约为66 kDa，与理论值一致（图4b—iii）。SIN与GBP5的缔合解离曲线以及KD（M）值为3.486 × 10−6的稳态曲线验证了它们之间的直接结合（图4c）。
3 SIN对LPS刺激的RAW264.7细胞的GBP5/P2X7R-NLRP3通路有抑制作用
病理状态下，由于免疫反应失调，GBP5也会异常上调。研究表明，GBP5在炎症反应中促进NLRP3炎症小体的组装，这在GBP5敲除小鼠和细胞培养模型中都得到了验证。结果显示，在LPS刺激的细胞中，SIN明显抑制iNOS的高表达，且在高剂量下差异明显（P < 0.05）（图6a）。也有报道称，P2X7R通过其活性影响细胞内钾水平，进而调控NLRP3的活性。因此，为了探究SIN的抗炎作用机制是否与NLRP3通路的调控有关，我们采用LPS诱导的RAW264.7细胞对该通路中的蛋白进行研究。IF（Immunofluorescence，免疫荧光）和WB（Western blot，蛋白质免疫印迹）检测结果表明，模型组中GBP5的表达明显高于正常细胞（P < 0.05）（图5a、6b）。此外，在炎症状态下，SIN会剂量依赖性地下调GBP5的表达（P < 0.01）。LPS诱导的巨噬细胞中P2X7R的表达也高于正常细胞（图5b、6c），且SIN对异常上调表达的P2X7R呈剂量依赖性抑制作用（P < 0.05）。更有趣的是，在中剂量（320 μM）下，SIN对P2X7R的抑制作用与A438
079相当。DEX（dexamethasone，地塞米松）组P2X7R表达水平较模型组降低，但二者无显著差异（P > 0.05）。此外，SIN抑制炎症细胞中NLRP3（图5c、6d）、ASC、caspase-1（半胱天冬酶-1）和cleaved caspase-1（活化型半胱天冬酶-1）的高蛋白表达（P < 0.05）（图6e、f、g）。
4 SIN降低LPS刺激的RAW264.7细胞促炎因子、ROS和Ca2+水平
P2X7R作为阳离子门控通道，其激活可导致细胞内大量Ca2+、Na+内流和K+外排，从而影响线粒体功能，刺激其分泌ROS（reactive oxygen species，活性氧）。P2X7R的激活导致PGE2和IL-1β的大量释放，甚至可能引起发烧。
图1 采用SIP联合蛋白质组学方法筛选经LPS诱导的巨噬细胞中与青藤碱相互作用的潜在靶蛋白。a对于SIP实验，RAW264.7细胞的总蛋白在体外用SIN孵育，在SDS-PAGE凝胶上电泳并直接扫描。b 通过蛋白质组学鉴定的蛋白分子量。c获得的质谱数据使用MaxQuant搜索引擎进行处理，串联质谱在人类 SwissProt数据库和反向诱饵库中进行检索。
我们前期研究发现，SIN可降低P2X7R mRNA水平。在本研究中，我们发现在LPS刺激的RAW264.7细胞中，SIN也明显下调P2X7R蛋白的表达（P < 0.05）（图5b, 6c）。因此，我们假设SIN对P2X7R的抑制作用可能会进一步诱导细胞内Ca2+和ROS水平的变化，这反映了在炎症时SIN对线粒体的影响水平。
图2 采用SIP联合蛋白质组学方法筛选经LPS诱导的巨噬细胞中与青藤碱相互作用的潜在靶蛋白。a, b富集分析105个差异蛋白在SIN/LPS中的生物学通路分布及分子功能。
此外，还需要确定SIN对NLRP3通路的调控是否影响细胞外IL-1β和IL-18的分泌及其对其他促炎细胞因子的调控。我们发现，SIN可有效降低炎症细胞培养上清中IL -1β、IL-18、IL-6和TNF-α的分泌水平，并且呈剂量依赖性（P < 0.05）（图7c-f）。此外，SIN还能有效降低ROS和Ca2+水平，这一点证明了SIN在炎症条件下对P2X7R活性有抑制作用（P < 0.05）（图7a, b, g）。此外，P2X7R特异性拮抗剂A438079和DEX也能有效降低Ca2+水平（P < 0.05）。DEX对ROS生成有抑制作用（P < 0.05），而A438079对ROS的抑制作用差异不显著（P > 0.05）。
5 SIN可减轻DBA/1型胶原诱导的关节炎模型小鼠的关节炎症状
我们进一步研究了SIN对胶原诱导的DBA/1小鼠炎症指标的影响。我们同样想在体内揭示SIN对P2X7R的调控作用。鉴于P2X7R拮抗剂A438079在炎症性疾病中的作用，本研究选择其作为阳性对照药物之一，另一阳性对照药物为目前治疗RA的首选药物MTX（甲氨蝶呤）。小鼠免疫和药物干预过程如图8a所示。正如图8b-f展示的那样，模型组与对照组在足部肿胀、足部厚度、炎症评分等指标上均有显著差异（P < 0.01），证明动物模型构建成功。分析之后观察小鼠体重变化，发现模型组小鼠体重与健康对照组相比呈下降趋势，最后一天测量结果有显著差异（P < 0.01）。
图3 GBP5蛋白被鉴定为青藤碱的直接结合靶点。a, b用AutoDock Vina软件预测SIN、GDP与GBP5的分子对接。c 采用CETSA法评估并验证SIN与GBP5的结合亲和力，用GraphPad的boltzmann sigmoidal拟合熔解曲线。
此外，SIN、A438079、MTX在一定程度上抑制了炎症状态小鼠的体重减轻。SIN高剂量组大鼠体重与模型组比较有显著差异（P < 0.05）（图8c）。在其他炎症指标分析中，SIN呈剂量依赖性地降低小鼠发病率，抑制足跖肿胀增厚，降低CIA小鼠关节炎症评分，特别是大剂量给药后，各指标与模型组差异显著（P < 0.01）（图8d-f）。此外，MTX组炎症评分低于模型组（P < 0.05）（图8e）。然而，P2X7R拮抗剂A438079对大鼠关节炎指标的影响与模型组无明显差异（P > 0.05）。
6 SIN降低II型胶原诱导的关节炎模型DBA/1小鼠的促炎细胞因子水平，并减轻关节炎症和骨破坏
由于关节是RA患者受影响最大的部位，因此我们选择CIA模型DBA小鼠足部组织作为靶组织，进一步进行病理和药理机制研究。我们进一步研究了SIN对CIA小鼠足部组织和骨骼微观结构的炎症水平和病理改变的影响。HE染色结果显示，SIN呈剂量依赖性地减少了CIA小鼠关节的炎症浸润和滑膜增厚（图9a）。此外，SIN呈剂量依赖性地减少关节炎症浸润和滑膜增厚，致使关节完整性提高。此外, 微CT（Microcomputed tomography，µCT）扫描结果显示，与模型组相比，SIN组足部组织无骨侵蚀，骨密度也有所提高（图9b, c）。
图4 GBP5蛋白被鉴定为青藤碱的直接结合靶点。a 采用pSmart-I载体，在BamHI-XhoI之间插入1-486氨基酸对应的核酸序列，并添加停止密码子，该密码子与C末端His标签未融合。b—i 采用12%还原SDS-PAGE和考马斯亮蓝染色检测GBP5蛋白（M:蛋白标准品，1:诱导沉淀，2:空白沉淀，3:诱导上清，4:空白上清，5:诱导全菌，6:空白全菌）。b—ii 纯化后的蛋白在10%还原SDS-PAGE凝胶上电泳，上样量为2 μg，然后用考马斯亮蓝染色。（M:蛋白标准品， 1:带Sumo标签的GBP5，2:不带Sumo标签的GBP5）。b—iii用10% SDS-PAGE和Western blot检测纯化和折叠后的蛋白（M: 蛋白标准品，1:不带SUMO标签的GBP5，2:带SUMO标签的GBP5）。以His-tag多克隆抗体作为一抗，稀释倍数为1:5000。二抗采用山羊抗兔IgG(H + L)-HRP，稀释倍数为1:20000。c 使用ForteBio Octet RED 96系统进行SIN和GBP5的结合亲和力测定。采用Octet BLI分析软件进行数据处理。饱和度曲线R2为0.978，KD（M）值为3.486 × 10−6。
此外，SIN处理的小鼠血清中IL - 1β、IL - 18、TNF -α、IL - 6和PGE2水平呈剂量依赖性降低（P < 0.05）（图9d-h）。MTX在对骨组织有保护作用的同时还降低了促炎因子水平（P < 0.05）（图9a-c）。与模型组相比，A438079组IL-6水平降低（P > 0.05）（图9e），但A438079对其他促炎细胞因子（P < 0.05）、骨病理和显微结构影响不大。
7 SIN抑制II型胶原诱导的DBA/1小鼠足部组织中GBP5/P2X7R-NLRP3通路的活性
为了进一步研究SIN在体内对GBP5、P2X7R和NLRP3及它们下游炎症反应的影响，采用DBA/1小鼠CIA模型进行体内机制研究。
图5 青藤碱调控经LPS诱导的RAW264.7细胞中GBP5/P2X7R/NLRP3通路的激活。a - c RAW264.7细胞接种于35 mm共聚焦培养皿中，密度为2.0 × 105个/孔，培养12 h后进行干预。换新培养基，提前1 h加药，向培养基中分别加/不加LPS，再孵育18 h，荧光显微镜下对细胞进行染色分析。
免疫组化和蛋白质免疫印迹是小鼠足部组织中蛋白质表型的主要检测方法（图10）。显微镜下观察染色组织切片（图10a），并使用Aipathwell分析软件定量阳性细胞百分比。模型组GBP5阳性、P2X7R阳性、NLRP3阳性细胞数/面积占总细胞数/面积的比例均高于正常对照组（P < 0.05）（图10b-g），证明动物模型成功建立。
图6 青藤碱调控经LPS诱导RAW264.7细胞GBP5/P2X7R-NLRP3通路的激活。a-g 细胞以2.0 × 105个/孔的密度接种于6孔板，用于药物和模型干预。然后，收集细胞进行WB检测，用ImageJ软件对波段灰度值进行分析。n = 3，数值表示为平均值±SEM， ##P < 0.01，###P < 0.001（与RAW264.7细胞相比），*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001（与LPS刺激的RAW264.7细胞相比）。
图7青藤碱剂量依赖性地降低了LPS诱导的RAW264.7细胞中促炎因子、ROS和Ca2+的水平。a，b 流式细胞术检测胞内ROS水平。字母C、M、SL、SM、SH、A、D分别表示对照组、模型组、160 μM SIN组、320 μM SIN组、640 μM SIN组、10 μM P2X7R拮抗剂A438079组和0.5 μM地塞米松组。c-f 用ELISA试剂盒检测细胞培养上清中IL-1β、IL-18、IL-6、TNF-α水平。g 使用激发波长为494 nm，发射波长为516 nm的多功能微孔板读取仪进行细胞内Ca2+水平测定。n = 3，数值表示平均值±SEM，#P < 0.05， ##P < 0.01， ###P < 0.001（与RAW264.7细胞相比），*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001（与LPS刺激的RAW264.7细胞相比）。
图8 青藤碱剂量依赖性地减轻CIA小鼠关节炎症状。a DBA/1小鼠注射免疫2次，药物干预1个月后处死，期间每2天测量炎症指标。b 解剖当天拍摄小鼠足底区，记录足部肿胀情况。c-f 每2天记录体重、关节炎指数、炎症评分、足底厚度，合并统计分析。N = 11，数值以平均值±SEM表示，## P < 0.01，### P < 0.001（与对照组相比），*P < 0.05， **P < 0.01（与模型组相比）。
此外，值得注意的是，SIN剂量依赖性地降低了这三种蛋白的组织分布和表达水平。此外，与模型组比较，A438079对NLRP3蛋白表达有抑制作用（P < 0.05）（图10f-g）。MTX对GBP5、P2X7R、NLRP3的表达也有明显的抑制作用（P < 0.05）。WB结果与IHC（Immunohistochemistry，免疫组化）结果一致，发现SIN剂量依赖性下调足部组织中GBP5、P2X7R、NLRP3、ASC、Caspase-1、Cleaved Caspase-1蛋白的表达（P < 0.05, P < 0.01, P < 0.001）（图11）。
图9 青藤碱降低了CIA小鼠的促炎细胞因子水平，减轻了关节炎症和骨破坏。a 固定CIA小鼠足部组织，进行HE染色，分析关节病理变化。b 以投影图像集为原料，利用Feldkamp算法创建横截面图像的数据集堆栈，即重建过程，生成被扫描对象的三维图像。c X射线投影图像是微CT成像过程的“原材料”。①、②、③分别为横断面、冠状面、矢状面。d-h 将CIA小鼠血清样本从- 80°C冷冻库中取出，使用ELISA试剂盒检测TNF-α、IL-1β、IL-18、IL-6和PGE2水平。n = 11，数值以平均值±SEM表示， ###P < 0.001（与对照组相比），*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001（与模型组相比）。
图10 青藤碱抑制CIA小鼠足部组织GBP5/P2X7R-NLRP3通路的活性。a各给药组的爪组织免疫组化染色。大一点的图是在原截面的基础上放大5倍的图像，黑箱小图是放大20倍的图像。b、d、f 采用Aipathwell自动图像分析软件分析足部组织中GBP5、P2X7R及NLRP3阳性细胞的比例，以阳性细胞数/总细胞数计算阳性细胞比。c, e, g计算阳性细胞面积/组织面积之比。n = 11，数值以平均值±SEM表示， #P < 0.05， ###P < 0.001（与对照组相比），*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001（与模型组相比）。
结合先前关于SIN降低CIA小鼠血清IL-1β和IL-18水平的证据，我们可以得出结论，SIN抑制GBP5/P2X7R-NLRP3通路的活性，这可能是SIN免疫抑制作用的部分机制（图12）。
讨论
1 GBP5是青藤碱的直接蛋白靶点
与化学蛋白质组学必须从药物分子中化学衍生不同，非化学修饰方法通过结合前沿的定量和定性蛋白质组学，可在蛋白质组水平上实现高通量、大规模、无偏倚的无药物修饰靶标筛选。近年来，研究人员开发了多种未经修饰的方法来研究药物-蛋白质相互作用，如细胞热位移分析、蛋白质氧化速率稳定性分析（SPROX）、药物亲和反应的靶点稳定性（DARTS）、化学变性剂和蛋白质沉淀（CPP）和热蛋白质组学分析（thermal proteome profiling，TPP）。利用这些方法成功地鉴定了FK506、雷帕霉素和白藜芦醇的靶点。在SPROX方法中，研究人员通过测量含甲硫氨酸残基的氧化速率与化学变性剂浓度的函数关系来评估蛋白质与配体结合后的热力学稳定性变化，从而揭示靶蛋白。DARTS利用了蛋白质与药物结合时更耐蛋白水解的原理。CPP是基于化学变性剂诱导蛋白质沉淀的原理来识别药物的蛋白质靶点。而CETSA作为一种新兴的监测靶点接触的方法，通过测量药物的变性来揭示药物靶点。虽然这些方法是验证药物靶点的合适工具，但它们不适合在蛋白质组学水平上发现未知的药物靶点。TPP方法的发展弥补了这一缺陷，该方法使用定量蛋白质组学方法来定量可溶性部分的蛋白质，而不必使用蛋白质免疫印迹读取，并且可以在蛋白质组学水平上鉴定配体诱导的蛋白质稳定性变化。以上方法都是基于配体诱导后蛋白质稳定性的原理，但有些蛋白质与配体结合后对氧化变性、蛋白酶水解、热变性不敏感。一些蛋白质，如BCR-ABL，在与达沙替尼结合后对热变性没有反应，这表明我们需要用不同的方法来识别真正的靶点。因此，我们开发了一种新的靶点筛选方法——SIP试验，它通过降低介电常数和竞争蛋白质水来沉淀蛋白质，而不是通过热变性诱导蛋白质沉淀。SIP的原理是，配体结合蛋白之后会对有机溶剂有更大的耐受性。此外，SIP方法获得的蛋白质组覆盖率与传统的自底向上实验相似，但优于SPROX。通过SIP方法对MTX和SNS-032两种模型药物进行验证和评价，成功揭示已知靶点。此外，热休克蛋白90家族的三个已知蛋白靶点，NADH脱氢酶亚基NDUFV1和NDUFAB1也被鉴定出来。然而，这些通过药理修饰筛选靶蛋白的方法仍存在一些不足。首先，配体药物与蛋白质的结合可能引起其他蛋白质的结构变化，导致假阳性。其次，对非特异性蛋白的干扰也是非化学修饰方法面临的问题。此外，一些靶蛋白与低丰度很容易被高丰度的靶蛋白覆盖，无法被检测到。
在此，我们采用的方法是结合SIP和蛋白质组学策略来寻找药物靶点。采用SIP法研究SIN与炎性巨噬细胞中提取的总蛋白共同孵育后是否产生差异结合，以及这些差异结合蛋白的总体分布，并采用蛋白质组学分析对结合蛋白进行定性和定量分析。为了直观分析，我们采用分子模拟的方法预测SIN和GBP5的结合能。此外，还对GBP5的结合能及其配体GDP进行评价。
RA患者过度的免疫反应往往导致能量代谢紊乱，以及嘌呤代谢增加。GDP是GTP代谢的产物，是GBP5的配体。虽然SIN与GBP5的结合能（−7.72 kcal）低于GDP与GBP5的结合能，但由于GDP是内源性能量代谢产物，因此具有一定的不稳定性。事实上，除了通过分子对接预测结合模式和结合能外，我们还通过分子动力学模拟对SIN与GBP5蛋白的结合进行动态分析。这些结果表明，在GBP5上SIN结合位能最高的前10个氨基酸与GBP5活性口袋位置上的氨基酸并不相同。根据分子对接模拟，可以有效结合SIN的氨基酸为ASP-182、LEU-245、SER-69、ARG-48、GLY-50、VAL-67和ALA-68，而根据分子动力学模拟，排名前十位的氨基酸包括LYS-232、LYS-231、LYS-230、PHE-228、PRO-229、LEU-176、PRO-174、HIS-143、THR-149和ARG-205。这一结果表明，SIN与GBP5的结合可能更加影响蛋白质的稳定性，而不是其活性。
虽然蛋白质组学已经证明了SIN与靶蛋白结合的潜力，但需要更多的分析策略来排除假阳性的可能性，并确认结果的真实性和可信度。由于蛋白质变性的原理不同，基于有机溶剂沉淀稳定性的SIP方法与基于热稳定性的CETSA方法具有不错的互补性。因此，我们采用了其他的蛋白质-分子相互作用测定，包括亲和力测定和CETSA，进一步进行证明。CETSA结果显示，SIN的热移值为4.25±0.87，结合呈剂量依赖性增加趋势，这一发现也支持了定量蛋白质组学的结果。这种结合的结果与Wang等人利用CETSA直接将酸枣仁皂苷A与FAT非典型钙粘蛋白4结合趋势相似。与SIP和CETSA等非修饰的蛋白质组学方法不同，我们使用的结合亲和法直接合成并纯化大肠杆菌中表达的hGBP5蛋白，将其与生物素连接，并特异性地与SSA生物传感器连接。此探针可以检测一定蛋白浓度下与SIN分子的结合信号强度，并评价它们之间的结合亲和力。该方法不受活细胞的影响，能直观地反映蛋白质与小分子之间的结合信号。因此，这种方法为SIN与GBP5蛋白的直接结合提供了结构证据。采用ForteBio Octet系统进行结合亲和实验，结果表明信号有效，KD（M）值约为3.486 × 106，表明SIN与GBP5具有良好的结合亲和性。综上所述，分子靶点鉴定实验均表明，SIN与GBP5蛋白直接结合。然而，虽然我们已经证实了SIN与GBP5的直接结合，但确切的结合位点尚未确定，因此还需要使用位点突变实验进行验证。
图11 青藤碱可抑制CIA小鼠足部组织中GBP5/P2X7R-NLRP3通路的活性。a-f 采用蛋白质免疫印迹检测液氮研磨、组织匀浆、蛋白提取后小鼠足组织中GBP5、P2X7R、NLRP3、ASC、caspase-1、cleaved caspase-1蛋白的相对表达水平。字母C、M、SL、SM、SH、MTX和A分别表示对照、模型、SIN（每天25、50和100 mg/kg）、甲氨蝶呤（10 mg/kg）和P2X7R拮抗剂A438079 （5 mg/kg）。n = 3，数值以平均值±SEM表示，##P < 0.01，###P < 0.001（与对照组比较），*P < 0.05， **P < 0.01， ***P < 0.001（与模型组比较）。
图12 SIN的分子机理示意图。SIN下调炎症细胞中P2X7R的表达，直接结合GBP5蛋白，从而抑制下游NLRP3/ASC/Caspase-1/Cleaved caspase-1通路，最终减少IL-1β和IL-18的分泌。此外，SIN通过抑制P2X7R调节细胞内钙水平，从而影响线粒体释放ROS。该结构图是利用科研者之家（Home for Researchers）的Figdraw平台绘制的，导出ID为PTSTlbbb4b。
2 青藤碱的一种新机制：直接靶向GBP5调控P2X7R抑制NLRP3相关信号通路
GBP5表达异常上调是由于病理状态下的免疫反应失调引起的，如RA影响的滑膜组织和一些人类恶性肿瘤（胃腺癌、骨髓癌、胶质母细胞瘤）。此外，它还与炎症性肠病和败血症相关性肝损伤密切相关。在确认了体外分子间相互作用结果后，我们进一步在分子水平上验证SIN对GBP5的调控作用。研究表明，SIN在体外和体内均下调GBP5蛋白的表达。在许多已知的炎性小体复合物中，研究最广泛的是NOD样受体家族，其中包括NLRP3的pyrin结构域。当被感染或细胞应激激活时，NLRP3与含有caspase募集结构域的ASC形成复合物，然后触发pro-caspase-1裂解为caspase-1。最终，它刺激促炎细胞因子IL-1β和IL-18的成熟和分泌，促进炎症细胞向靶细胞和器官募集。研究表明，下调GBP5可抑制NLRP3炎性小体的激活及IL-1β和IL-18的分泌，从而减缓狼疮性肾炎的发展。有趣的是，我们的数据表明，SIN阻断了下游NLRP3/ASC/Caspase-1/Cleaved caspase-1通路，最终导致分泌的IL-1β/IL-18水平降低。此外，研究表明，小分子与蛋白质的结合可能会影响该蛋白质的降解，从而在相关信号的调节中发挥作用。例如，香菜的主要成分arnicolide D可以结合原癌基因酪氨酸激酶蛋白，并可能促进前列腺癌细胞中酪氨酸激酶蛋白的降解。研究结果还表明，SIN可以直接结合GBP5蛋白并下调其蛋白表达，但未评估GBP5 mRNA水平和GBP5蛋白活性。因此，我们目前无法确认SIN是否仅在蛋白水平上影响GBP5的降解，从而降低其检测到的表达水平。或者，青藤碱与GBP5的直接结合可能导致蛋白质活性降低，引发下游级联效应。因此，这些问题仍有待探索。此外，GBP5是一种干扰素诱导蛋白，炎症性巨噬细胞中GBP5表达上调通常与IFN-γ水平升高相关。然而，IFN-γ水平尚未被测量，因此需要进一步研究。
P2X7R是一种ATP门控受体，主要通过激活NLRP3活性，促进促炎因子的成熟和非经典分泌参与炎症反应，在免疫和自身免疫中发挥关键作用。P2X7R在机体几乎所有组织中广泛表达，覆盖多种细胞，包括单核/巨噬细胞、T细胞、成纤维细胞、肥大细胞、小胶质细胞、上皮细胞、胰腺内分泌外分泌细胞等。单核-巨噬细胞系是免疫炎症系统细胞中分布最广的细胞系。越来越多的研究表明，P2X7R可能是骨关节疾病的关键调控因子和潜在靶点。我们的研究首先证明了SIN降低了RAW264.7细胞中P2X7R的表达水平和分布，并显著抑制了CIA小鼠P2X7R蛋白的表达。SIN对P2X7R的这种调节作用伴随着细胞内Ca2+水平的剂量依赖性降低和线粒体ROS产生的进一步减少。这一发现表明，SIN也可能调节炎症细胞中的线粒体功能，但这一概念尚未得到研究。在低剂量下，SIN对炎症细胞和组织的作用与P2X7R特异性拮抗剂A438079相似。A438079对NLRP3及其下游级联的影响在细胞中明显，而动物的抗炎和骨组织保护作用与模型组无明显差异。然而，这与先前A438079在CIA小鼠中的结果不同。对于拮抗剂本身来说，这一结果无疑是一个有趣的现象，其潜在的机制仍有待探索。此外，免疫组化染色结果显示，炎症状态下，GBP5、P2X7R和NLRP3蛋白在骨髓相关细胞中高表达，而免疫阳性细胞在滑膜细胞中的分布不显著。这可能是由于骨髓中含有骨髓源性巨噬细胞和祖细胞，而GBP5正是从炎症性RAW264.7细胞中筛选出来的靶蛋白。然而，这些蛋白是否在炎症状态下的滑膜细胞中高度表达，还有待进一步探索和验证。综上所述，GBP5和P2X7R对下游NLRP3信号通路都有串联作用，这让我们怀疑P2X7R和GBP5是否相互关联。这一假设还需要进一步的研究。总而言之，根据文献报道和我们实验数据的分析，NLRP3在炎症环境中受GBP5和P2X7R的共同调控。SIN对该通路的调控主要依赖于直接结合GBP5并抑制其表达，部分依赖于抑制P2X7R的表达。
如图12所示，我们的研究表明，SIN直接与GBP5结合，从而抑制其活性，并协同调节P2X7R抑制下游NLRP3诱导的炎症通路。由于目前还没有GBP5拮抗剂的报道，因此SIN对GBP5的直接结合特异性及其对GBP5活性的抑制作用显示了其作为GBP5拮抗剂的巨大潜力。这些药理结果结合我们之前的分子相互作用研究表明，GBP5也是炎症细胞中SIN的潜在靶点。虽然本研究在一定程度上揭示了SIN的新的抗炎靶点和机制，但仍存在许多不足和局限性。例如，虽然我们已经证实了SIN与GBP5直接结合，但确切的结合位点还没有确定。GBP5是鸟苷结合酶，与之结合后，SIN可以下调其表达。然而，由于缺乏现有的活性检测试剂盒，没有对SIN对其酶活性的影响进行进一步的测试，SIN是否影响GBP5的功能活性尚不清楚。此外，SIN对GBP5蛋白稳定性的影响也有待进一步探讨。在选择细胞类型时，我们选择LPS刺激的RAW264.7细胞而不是人源性细胞去进行蛋白质组学靶点筛选，这表明在临床病例中获得的差异靶点可能与实际靶点不完全匹配，并可能增加GBP5作为SIN治疗RA等炎症性疾病靶点的争议。此外，本研究的分子机制尚未在基因敲除或过表达的细胞或动物模型中得到验证，这使得SIN调控GBP5靶点的分子机制的证据链不完整。
结论
本研究首次利用蛋白质组学分析和分子-蛋白相互作用分析，创新性地证明了SIN可以高效、直接结合GBP5。通过综合药理评价，我们的数据显示GBP5可能是SIN抗炎作用的潜在靶点。结果表明，SIN抑制GBP5/P2X7R-NLRP3信号通路，在体内和体外均可减轻炎症。我们的研究也为GBP5作为炎性疾病如RA的治疗靶点提供了依据。同时值得注意的是，本研究为利用SIN治疗包括RA在内的炎症相关疾病提供了新的分子基础，并为SIN在自身免疫性疾病、癌症等炎症相关疾病中的应用提供了参考。
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https://www.nature.com/articles/s41401-023-01124-4#ethics
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