脂肪肝的主要特征是肝脏中脂肪沉积过度,患者的临床表现有肝细胞炎症和肝纤维化等。
脂肪肝包括非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)和酒精性脂肪性肝病(AFLD),区分NAFLD和AFLD的重要指标是患者的饮酒情况,AFLD是过量饮酒导致的脂肪肝,而NAFLD是排除过量饮酒和其他特异性肝损伤因素,与代谢综合征和胰岛素抵抗有关的疾病,其主要特征是肝细胞内脂肪过度沉积。
引起NAFLD的因素有超重、胰岛素抵抗、缺少运动、高脂高糖的饮食模式、遗传因素和肠道菌群失调。
目前,脂肪肝在全球的患病率日益增长,在亚洲NAFLD的发病率高达29.62%。
研究脂肪肝使用的手段有动物模型和细胞模型,动物模型能模拟体内环境,但实验周期长、个体差异大;而细胞模型能克服个体差异的影响,更简便、高效,适于开展高通量的药物筛选和机制研究。
根据脂肪肝的特征建立细胞模型,如采用高糖高脂和酒精诱导细胞,检测细胞糖脂代谢的情况,建立脂肪肝细胞模型,进而筛选出可以改善脂肪肝的食品功能因子。
下文将从细胞类型选择、细胞培养方式和干预条件这几方面来进行综述。
脂肪肝细胞模型
肝细胞可分为两大类。肝实质细胞即正常肝细胞和胆管细胞,分别占肝细胞总数的70%和3%~5%,构成了肝脏的主要基质;非实质细胞主要包括内皮细胞、枯否细胞和星状细胞,约占肝细胞总数的25%。
现有的模型细胞可以分为:人原代肝细胞、动物原代肝细胞、永生细胞系、诱导多能干细胞(iPSCs)源性肝细胞样细胞(HLCs)和肝切片。
1. 人原代肝细胞
人原代肝细胞在较大程度上保留了细胞在体内器官里的功能,各种物质代谢功能和酶活性与体内的肝细胞极其相似,是最为接近临床的一种标准体外短期培养模型。人原代肝细胞通常从肝或肝组织中获得,一般在肝切除手术中或者肝移植后排斥的肝组织中获取,随后即时进行研究或者冻存待用。
模型举例：
人原代细胞胞LO-2(HL-7702)：
①.细胞培养：
LO-2细胞解冻复苏后，培养在含10%胎牛血清的DMEM－F12培养基中，放置于37℃，含5%二氧化碳的培养箱，待细胞增殖至75%～85%时，常规消化、传代，冻存。
②NAFLD细胞模型的复制：
油酸钠和棕榈酸钠摩尔浓度比2∶1配制脂肪酸母液。使用完全培养基倍数稀释脂肪酸母液，稀释为1.2mmol·L－1的脂肪酸造模液，用以复制NAFLD细胞模型。
③分组处理：
将LO-2细胞分为正常组、模型组、阳性对照组和实验组。正常组细胞使用完全培养基培养;模型组细胞使用1.2mmol·L-1脂肪酸造模液培养;阳性对照组细胞使用1.2mmol·L-1脂肪酸造模液，并加入浓度为192μmol·L-1的α－LA干预;实验组细胞使用1.2mmol·L-1脂肪酸造模液，加入浓度为100mg·L-1的HPS干预。各组均干预24h后检测指标。
④模型评价：
油红O染色法观察细胞脂肪变性。
GPO-PAP酶法检测细胞TG含量。
流式细胞术检测细胞凋亡率。
RT-PCR检测细胞GＲP78和SＲEBP－1c基因表达情况。
WB检测细胞GＲP78和SＲEBP－1蛋白表达情况。
2.动物原代肝细胞
鉴于人原代肝细胞存在数量稀缺和伦理道德等问题,研究人员尝试从动物肝脏中分离原代肝细胞,用来体外培养并进行研究。使用较多的是啮齿动物,还有一些哺乳动物和鱼类。
模型举例：
①细胞分组：
将AML-12细胞随机分为五组：正常对照组、给药组、PA组、PA＋阳性药预处理组。
另外，对SIRT1进行RNA干扰实验分为五组：正常对照组、PA组、PA＋阳性药物预处理组、PA＋SIRT1siRNA预处理组、PA＋阳性药物＋SIRT1siRNA预处理组。
②细胞培养：
小鼠正常肝脏细胞（AML12）。AML-12细胞使用F12培养基（含10％FBS、40ng／L地塞米松、１％Insulin-Transferrin-Selenium（100Ｘ））。恒温培养箱中（37℃、5％二氧化碳饱和湿度），定期换培养液。
③细胞造模：
将PA和BSA混合制成１ｍMPA储备溶液。为了建立NAFLD的细胞模型，然后将AML-12细胞暴露于200μMPA中24ｈ后给予不同剂量的阳性药物进行治疗。
④模型评价：
检测ALT、AST、TC、TG、MDA水平及SOD活力。
免疫印迹WB
SIRT1-siRNA转染
RNA提取及qRT－PCR.
3. 永生细胞系
永生细胞系能够无限传代, 通常使用的永生化手段是在人原代肝细胞中过表达病毒致癌基因和(或)人端粒酶逆转录蛋白基因。
常用的永生细胞系有人肝癌细胞系HepG2、人正常肝细胞L02、人肝癌细胞系HuH7、人肝癌细胞系HepaRG和人肝星状细胞系LX2等。
不同细胞系的优势与不足
细胞培养方式
1. 单独培养模型
单独培养是指一种类型的细胞贴壁培养,这是最基础的一种培养方式,无论是原代细胞、永生系细胞都可以进行单独培养。
单独培养技术的优点是周期短、效率高,有利于高通量药物筛选实验,所以普遍应用于脂肪肝的研究。
单独培养模型由于相对简单,在研究中应用较多,但它们缺乏维度,没有介质流,只有一种类型的细胞,缺少其他类型的细胞,如枯否氏细胞、星状细胞和巨噬细胞等,缺乏细胞之间的相互作用。
2. 共培养模型
共培养模型可以弥补单独培养模型的缺陷,在模型中引入第二种细胞,增加了细胞之间的相互作用,可以更好地模拟肝脏的生理机能。
人原代肝细胞与内皮细胞共培养可支持肝细胞维持其表型形态,改善其特定功能,并可形成毛细血管样结构,更有利于模拟体内环境,研究脂肪肝病的病理机制。枯否氏细胞是位于肝血窦的一种巨噬细胞,可以分泌炎性细胞因子。人原代肝细胞和枯否氏细胞的共培养可以评估促炎环境下的肝细胞反应。
相关学者建立了一种HepG2细胞与THP-1巨噬细胞共培养的模型,先将巨噬细胞贴壁于无菌载玻片,随后将载玻片放入接种了HepG2细胞的6孔板中,加入浓度为1mmol/L的混合脂肪酸(PA和OA的比例为1:2),诱导24h后建立了NAFLD模型。
共培养模型的优点是弥补了单独培养模型的不足,培养条件简单,还能进行高通量实验。但是现有的共培养模型种类不多,未来还有很大的发展潜力。
3. 三维培养模型
三维培养常用的方法有支架培养和悬浮培养这两种。
常用的支架材料有水凝胶、胶原蛋白和层黏连蛋白等,支架可以支撑肝细胞,形成类似细胞间接触和细胞间基质的相互作用。悬浮培养是指细胞在悬浮条件下自发聚集形成球体,这种方法操作简单、费用低、应用广泛。
三维培养还分为三维单细胞培养和三维共培养,下文是对两者的说明。
3.1三维单独培养模型
往期学者建立了一种三维的人原代肝细胞模型,模型组含有0.6mmol/L的脂肪酸,对照组和模型组都添加了适宜浓度的胰岛素和葡萄糖。培养7天后,模型组脂质积累明显增多,14天后进一步增加,模型组消耗的脂肪酸是对照组的4倍多。造模后细胞的AST、ALT泄漏量无显著变化,表明细胞活性正常,不受造模液影响。细胞内谷胱甘肽水平、LDH释放、尿素生成和线粒体活动也不受造模液的影响,证明此三维模型的细胞功能齐全。
基因CYP2E1、IGFBI、PDK4和CYP7A1的表达量都显著升高,表明模型具有脂肪变性特征。此模型检测二甲双胍等抗脂肪肝药的效果显著。
三维模型能更好地模拟体内环境,培养时间更长,有利于进行反复诱导实验。球体三维模型可用于高通量筛选实验,效率较高。缺点是建立三维模型非常耗时并且昂贵,由于其仍处于早期使用阶段,有些功能还有待验证。
3.2三维共培养模型
三维共培养模型可用于研究更复杂的脂肪肝表型,如炎症和肝纤维化。在三维共培养模型中,人肝细胞与非实质细胞一起培养,可以在三维空间模拟肝内各种类型细胞之间的相互作用。三维共培养模型的优点是能长期维持重要的代谢功能,并在相关条件下诱导脂肪肝病理表型。
往期学者使用瑞士InSphero品牌的三维人肝微组织系统,将原代人肝细胞与肝星状细胞、枯否氏细胞和内皮细胞共培养,使用PA诱导细胞,成功建立了脂肪肝模型。模型显示,PA显著增加了炎症因子以及促纤维化基因的表达(包括胶原基因、α-平滑肌肌动蛋白、金属蛋白酶组织抑制因子1、血小板衍生生长因子受体-β以及白细胞介素-8),造成肝微组织的损伤。还检测到转化生长因子β通路被激活,使用GS-4997(一种凋亡信号调节激酶ASK-1的抑制剂)进一步验证该模型,结果显示,GS[1]4997显著降低了PA诱导的炎症和纤维化反应,同时降低了细胞凋亡和肝星状细胞的活化。
三维共培养模型的缺点是操作复杂和价格昂贵,还需要继续提升技术和完善功能,从而在科研中得到更广泛的利用。
脂肪肝细胞模型所用的细胞类型多种多样,培养的方法也各不相同。每种细胞模型都有自身的优缺点,研究者可根据实验环境、研究目的等因素选择适当的细胞模型对脂肪肝进行研究。
脂肪肝细胞模型的干预条件
1. 高脂诱导
医用脂肪乳剂毒性低、溶解性好、操作简便、经济实惠。
PA和OA是人体中最丰富的膳食长链脂肪酸,是目前NAFLD造模中最常用的脂肪酸,但是脂肪酸存在溶解性差的问题。
为了使其更好地溶解于培养基,一般使脂肪酸与BSA以5:1的比例结合,溶解后再用培养基稀释至所需浓度。
2.高糖诱导脂肪肝
有研究证明,高果糖摄入与NAFLD和肝纤维化相关。
相关研究检测到果糖浓度在32mmol/L以下时对细胞活性无影响,果糖浓度不低于4mmol/L时能显著增加细胞内脂质,并上调乙酰辅酶a羧化酶1、SREBP-1和碳水化合物反应元件结合蛋白的表达。
同时也有学者使用5~25mmol/L葡萄糖和/或5~25mmol/L果糖在1mmol/L混合脂肪酸(PA和OA浓度比为1:2)存在的条件下诱导HepG2细胞24h,监测脂质和尿酸生成、葡萄糖代谢、氧化状态以及相关基因和蛋白的变化。
结果表明,PA可以诱导胰岛素抵抗、氧化应激和脂质积累,OA促进细胞内脂质积累,而果糖可以促进尿酸和胆固醇的产生,果糖、葡萄糖和脂肪酸协同提高细胞内外TG和细胞外的MDA。
3.酒精诱导脂肪肝
肝脏是储存铁的主要部位,机体出现AFLD时,肝铁含量增多,铁会促进肝细胞的脂质氧化,从而损害肝细胞。但是低浓度的酒精对细胞活性没有显著影响。
相关学者为了探究玉米肽和姜黄素对AFLD的作用时,在HepG2细胞培养基中加入浓度为1mmol/L的OA、玉米肽和姜黄素共同培养20h后,加入0.6%的无水乙醇继续培养4h,建立了AFLD的细胞模型,检测到模型组细胞的ALT、AST和LDH泄漏量显著增多,提示发生细胞损伤;胞内TG、MDA和乙醇脱氢酶含量显著增多,提示细胞内脂质和脂质过氧化产物增多。
综上，高脂、高糖和酒精都可以诱导细胞脂肪变性,一般来说,浓度越高,作用时间越长,诱导脂肪肝的效果越好,但是酒精浓度过高会影响细胞存活率。
不同的细胞系对糖类、脂类、酒精的敏感性也有所不同,研究者需要预先筛选出适当的造模液浓度。
NAFLD的检测指标有TG、TC、糖原、ROS水平、炎症因子。
AFLD的检测指标有TG、TC、ROS、AST、ALT、MDA、乙醇脱氢酶等。
END
参考文献：
张 磊，万生芳，李亚玲.红芪多糖对非酒精性脂肪肝病细胞模型的干预效果. 中国临床药理学杂志 ，DOI: 10. 13699 /j. cnki. 1001 － 6821. 2023. 02. 012
任振晓 张佳佳 ，丹酚酸 Ｂ 对非酒精性脂肪肝细胞模型SIRT1／SIRT3信号通路的研究,齐齐哈尔医学院学报2022年第43卷第24期
转自：“晶莱生物”微信公众号
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