第一作者：Beibei Zhao, Jianqiang Feng, Lu Yu
通讯作者：Changlin Tian，Binju Wang，Xiaoqiang Huang
通讯单位：中国科学院强磁场科学中心，中国科学技术大学，厦门大学，南京大学
DOI：https://doi.org/10.1038/s41929-023-01024-0
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背景介绍
扩大酶的合成功能对于加速生物制造的发展非常重要，因此是学术界和工业界的核心目标之一。除了蛋白质工程、合成试剂的使用和人工酶的开发利用之外，光激发酶正吸引着越来越多研究人员的关注，因为光激发提供了获得多功能化学中间体的温和途径，从而为开发新的生物催化机制和转化提供了更多的可能性。Beisson 及其同事最近发现的变色小球藻（CvFAP）脂肪酸光脱羧酶（图 1a）就是最杰出的例证之一。他们关键的机理发现是：可见光激发的黄素腺嘌呤二核苷酸（FAD）辅助因子可启动脂肪酸的单电子转移（SET）氧化作用，从而使 CvFAP 成为催化各种非天然生物转化和沼气生产的成功天然光酶。目前，最先进的非天然光酶催化通常依赖于紫外线激活或电子供体-受体复合物的形成。
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本文亮点
受自然界的启发，本研究开发了一种基于可见光直接激发黄素蛋白的生物催化方案，以实现富电子烯烃分子间自由基氢化的立体控制。在可见光活化后，黄素依赖性烯还原酶--自然催化活化烯的双电子还原--被重新用于引发烯的单电子氧化，并以氧化还原中性和对映体分歧的方式产生C（sp2）-C（sp3）键形成的产物，同时用不同的酶获得两种对映体。实验和计算模拟证明，该反应是由直接可见光激发的黄蛋白对底物的单电子氧化引发的，并解释了这种自由基加氢反应中对映体选择性的来源，而这种对映体选择性是化学催化法难以实现的。本工作扩大了光酶催化的范围，并将促进进一步生物转化的发展。
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图文解析
图1|受自然启发开发光酶水解技术
要点：
1.要实现非天然光酶催化，通常需要将合成光催化剂与酶结合使用，或者将紫外线（UV）可激活的非天然氨基酸通过基因技术整合到精致的人工光酶中。另一个重要的策略是利用电子供体-受体（EDA）复合物 ，如一些学者所开发的那样（图 1b）。一般来说，氧化还原酶的还原黄素/烟酰胺辅助因子与缺电子底物之间形成的 EDA 复合物可在可见光下活化，然后引发一系列净还原自由基转化。尽管采取了上述策略，但要实现非天然酶的反应性，仍然非常需要推进新的酶的光激活模式。
2.受天然光酶 CvFAP 激活模式的启发，本研究在此介绍一种光生物催化方案，其特点是由可见光激发的黄蛋白直接氧化SET，并报告了富电子（杂）烯烃的非天然氧化还原中性羟基化（图 1c）。与过渡金属或手性布氏酸催化的对映选择性加氢反应相比，这种生物催化方案不仅能以可持续、氧化还原、原子经济和对映扩散的方式形成 C(sp2)-C(sp3)键，而且还为自由基加氢反应中的立体化学控制难题提供了一种前所未知的解决方案。
图2|本研究设计的催化循环
要点：
1.在通过可见光直接激发实现非天然双分子反应方面，黄蛋白尚未参与其中。除了光诱导自由基过程的不对称诱导存在固有困难外，关键的挑战还在于受激黄蛋白的反应。首先，可见光激发的醌态黄素容易被反应缓冲液或相邻氨基酸还原（图 2，路径 b）。其次，非天然底物的正向单电子氧化必须与无益的反向电子转移竞争（图 2，路径 c）。第三，黄素蛋白溶液中未结合的游离黄素的平衡浓度可能导致外消旋背景反应。
图3|生物催化立体异构自由基加氢反应的底物范围
要点：
1.接下来，本研究利用野生型 GluER (ER1)、GluER_T36A-Y177F (ER2)、OYE1_F296A (ER3) 和/或 OYE1_F296G (ER4)研究了底物的范围，以获得产物的两种对映体（图 3）。一系列取代的甲基苯乙烯顺利进行了立体异构加氢反应，在对位/偏位/正位上的不同官能团如苯基（3a-i）、2-萘基（3j）、噻吩基（3k）、苯并呋喃基（3l）和苯并噻吩基（3m）都能很好地耐受。氢化产物的转化率高达 1.5:98.5er（3k 的转化率为 ER3），产率从良好到极佳，突出了生物催化与杂环的兼容性。
图4|机理实验
要点：
1.随着生物催化方案的确立，本研究进行了几项湿实验来验证所提出的机制。首先测量了烯还原酶的光物理特性，以确定可见光激发的物质。紫外-可见吸收光谱显示，烯还原酶 ER3 在400-520 纳米波段吸收可见光，在 460 纳米波段有最大吸收，与游离 FMN-Na 相比有轻微的红移和吸光度增强（图 4a）。
2.从吸收光谱的长波长尾部可以粗略估计激发态 E00 的能量为 2.25 eV。根据已报道的 FMNox/FMNsq氧化还原电位（相对于饱和甘汞电极（SCE）为 -0.49 V），ER3 的激发态氧化电位相对于 SCE（ER_FMNox*/ER_FMNsq）估计为 +1.76 V，这能够通过底物 1a 的氧化（相对于 SCE 为 +1.42 V）而不是2a（相对于 SCE 为 +1.91 V）启动单电子过程。事实上，Stern-Volmer 发光淬灭实验也支持 1a 对激发的黄素蛋白进行初始还原淬灭（Int. B → Int. C），因为与 2a 相比，加入 1a 后 ER3 的荧光强度会降低。此外，氧化还原电位低的烯也能被激发的 FMNox* 氧化。
3.接下来，为了进一步支持关键的光氧化机制并阐明所产生的自由基中间体，本研究设计并进行了一组电子顺磁共振（EPR）实验。在低温 EPR 实验中，在酶、底物和可见光存在的情况下，观察到了与FMNsq 相对应的信号（图 4b）。在含有 ER3 和 FMN-Na 的系统中，FMNsq信号出现的速度（1 分钟）比仅含有 ER3 的系统（30 分钟）快得多，这与加入 FMN-Na 后反应效率的提高是一致的。
4.添加 5,5-二甲基-1-吡咯啉 N-氧化物（DMPO）作为自由基捕获剂后，室温下记录到六条线的 EPR 信号（DMPO-R，g = 2.006，AN = 15.9 G，AHβ= 23.5 G），这表明在添加 1a 而不是 2a 后形成了潜在的 1a 衍生自由基，这与淬灭实验一致。总之，这些结果支持激发的 FMNox*对 1a 进行 SET 氧化，形成 FMNsq 和芳基自由基阳离子（内 B → 内 C），而涉及 FMNsq 激发的途径则可以排除。
图5| OYE1_F296G 光酶水解作用的计算研究
要点：
1.为了更好地理解关键的光氧化机制，本研究进行了与时间相关的密度泛函理论计算。与实验结果一致，计算得出醌态黄素吸收可见光的最大波长为 434 nm，而由黄素和 1a 组成的潜在 EDA 复合物的最大吸收波长为 382 nm。此外，从 1a 到激发的 FMNox* 的 SET 放热 2.3 kcal mol-1（图 5a），支持了可见光触发的单电子氧化在热力学上有利的前提。
2.为了研究 OYE1_F296G（Int. C → Int. E）对自由基过程的对映体区分，本研究进行了经典分子动力学（MD）、量子力学/分子力学（QM/MM）MD 模拟和 QM/MM 计算，结果表明，其顺序途径为：自由基阳离子加成→质子转移→氢原子转移（图 5c）。
3.首先，完全松弛的 QM/MM MD 模拟显示，底物 1a 自由基阳离子（1a-+）和 2a 都可以持久地结合在 OYE1_F296G 的活性位点上，其中 1a-+ 可以与 FMNox 形成 π-π 堆积，类似于已报道晶体结构中原生底物的结合，而 2a 则位于 FMNox 的上方和 1a-+ 附近。有趣的是，底物 2a 在 Int. C 中的底物 2a 可采用两种不同的构象，其中 CH3 基团可在其中或在其外（图 5b）。
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总结与展望
本研究开发了一种光酶法方案，其特点是通过直接可见光激发的烯还原酶实现单电子氧化引发自由基机制。烯还原酶被转化为光氧化剂，并催化非天然、氧化还原中性自由基的羟化反应。这种对映变异的光酶法方案有 27 个实例，其对映变异率和产率分别高达 99:1 和 99%，是一种立体控制自由基型 C(sp2)-C(sp3)耦合的策略。详细的机理研究揭示了激发的黄蛋白如何发挥光氧化剂的作用、控制自由基的立体化学并避免不良途径。所开发的酶光激活模式有望激发更多的非天然生物转化。
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