【实验技巧篇】定点突变的构建，能为科研生涯傍身的技术

一、概念及应用

定点突变是一种在已知序列中产生特定突变的体外方法。定点突变是一种高度通用的技术，可用于以定制的方式引入特定的核苷酸替换（或删除）。比如，我们在研究蛋白质的功能时，经常需要验证基因突变后对功能的影响，包括定点突变，插入突变，缺失突变等；或是当我们想在目的基因的N端或C端加入功能型标签以利于后续实验相应抗体的检测，如his tag，flag tag等；或是想对质粒进行调节元件的改造（在报告质粒中突变启动子/增强子），此时都可通过突变PCR来构建突变的质粒。

二、定点突变过程的几个阶段：

设计引物，突变pcr，模板消化，转化测序

三、操作和注意事项

（1）引物设计：正向引物和反向引物为两条互补匹配的引物。突变位点上下游各匹配至少11bp（否则难以成功退火到模板质粒上），单独TM值≥45℃，总tm值大于78摄氏度，引物总长度25-45bp，引物尽量避免形成引物二聚体或自身发夹结构。

推荐使用在线网站，可以快速设计引物 https://www.agilent.com.cn/store/primer DesignProgram.jsp

如果突变位点比较接近，可同时设计一对引物进行突变，如下图的G12D/G15E

（2）突变PCR：循环数18-22个，过高容易引入新的突变；模板量约50-200ng/50ul体系，量过低或过高都会影响pcr效果；使用高保真DNA聚合酶，如pFU酶，否则可能引入其他突变；延伸时间要根据模板大小和DNA聚合酶的延伸能力来调整；一般6kb质粒均可有效扩增。

（3）模板消化：为了去除模板DNA（未修饰的质粒），使用DpnI进行消化。DpnI的独特之处在于它只酶切在GATC识别位点的腺苷上被甲基化的DNA。因此质粒模板应从具有甲基化能力的大肠杆菌菌株中分离出来（如DH5α，它是Dam+）。注意：模板质粒也能在转化时长出克隆，因此在模板消化时需要充分（可根据说明书适当延长消化时间，一般1-2h；并根据酶配套的加入相应buffer，如NEB），尽可能避免假阳性。

（4）转化测序：转化时取2ul消化产物，若转化过多，DPN1酶有毒性，影响细菌生长。37℃倒置培养过夜。选取单克隆进行测序。

转自：“中北科研”微信公众号

如有侵权，请联系本站删除！