孟德尔随机化联合PheWAS：减少SNP的多效性干扰，验证GWAS鉴定的基因-表型关联，揭示不同疾病的共同遗传易感机制。
具体来讲：
（1）GWAS数据中一些强相关的SNP，仅能解释对表型部分的影响。
（2）有些找出来的SNP不在基因转录片段内（而是存在于内含子、无义编码区等），那这样得到的与表型强相关的snp则解释不清了。
（3）对于MR而言，剔除的混杂因素存在个人主观性；PheWAS还可以帮助解决GWAS在基因多效性的不足之处（1个snp真的就只能和一个表型强关联？）PheWAS具有发现多效性遗传位点的能力，即遗传变异与两种及以上表型显著相关。遗传多效性的鉴定为揭示不同疾病的共同遗传易感机制提供了重要线索。
（4）既然是全表型，这就帮助我们发现某一snp的新遗传关联；不仅可以验证GWAS鉴定的基因-表型关联，而且能挖掘GWAS未发现的多效性遗传变异位点；发现药物新靶标，从而加速医药产业的发展。
类风湿性关节炎 (RA) 是一种慢性炎症性疾病，主要影响手和脚的关节，可平均缩短 3 至 10 年的预期寿命。尽管类风湿性关节炎的治疗已经取得了巨大进展，但仍有很大一部分患者对现有药物反应不佳，部分原因是缺乏适当的治疗靶点。
今天小盟今天分享的文章是2023年9月11日发表于《J Transl Med》（IF 7.4/Q2）题目为Identification of potential drug targets for rheumatoid arthritis from genetic insights: a Mendelian randomization study从遗传学观点确定类风湿性关节炎潜在药物靶点：一项孟德尔随机化研究。本研究旨在通过孟德尔随机化分析寻找RA的治疗靶点。
研究方法
为了寻找 RA 的治疗靶点，进行了孟德尔随机化 (MR)。顺式表达数量性状位点（cis-eQTL，暴露）数据从 eQTLGen 联盟获得（样本量 31,684）。RA（结果）的汇总统计数据来自两个最大的独立队列：样本量分别为 97,173 例（22,350 例病例和 74,823 例对照）和 269,377 例（8279 例病例和 261,098 例）。共定位分析用于测试 RA 风险和基因表达是否由常见的 SNP 驱动。进一步利用药物预测和分子对接来验证药物靶点的药用价值。
主要结果
1.发现阶段，32个基因与RA风险显著相关
目前RA特征的最大GWAS是2022年的一项大型多民族研究，包含22350例病例和74823例欧洲血统的对照。在发现队列中，32个基因的表达与RA风险有因果关系（p＜1.96E−5＝0.05/2554，Bonferroni校正2554个药物靶点）。然而，当进行灵敏度分析时，BRSK1基因在三种方法中的效应值方向不一致，CD226和MMEL1基因未通过水平多效性测试（P<0.05），因此这三个基因被排除在随后的分析之外。异质性测试的结果表明ITPR3、HLA-DPA1、C5、MMEL1和CTLA4的SNPs之间存在异质性。
2.复制期12基因在独立RA队列中仍然具有重要意义
在复制阶段，本研究使用了来自芬兰FinnGen数据库包含8279个病例以及261098名欧洲血统的对照。以与发现队列相同的方式进行MR分析。使用Wald比率或IVW方法，12个基因的遗传预测表达被复制为与RA风险有因果关系（Bonferroni校正后显著，P＜0.0017＝0.05/29），如图4所示。由于三种方法的效应值方向不一致，CTLA4基因被排除在随后的分析之外。水平多效性测试显示任何基因都没有显著的多效性。在异质性测试中，HLA-DRB1、ITPR3、CTLA4、FCGR2B、CCR6和HLA-DPA1基因显示出SNP间异质性。此外由于发现阶段和复制阶段之间的效应估计方向不一致，HLCS基因被排除在随后的分析之外。
3.共定位分析
先前的研究表明，显著的MR结果可能源于SNPs处于紧密连锁不平衡的位点，并且SNP暴露和SNP结果关联源于两个不同的因果SNPs，因此可能导致推断的假阳性结果。共定位分析可用于探讨当SNP与暴露和结果明显相关时，暴露和结果共享相同的因果SNP。有证据表明，经过MR和共定位测试的蛋白质更有可能成为药物靶点，也更有可能获得批准。因此，本研究决定使用发现阶段数据对先前分析中提出的11个基因进行共定位。如表1所示，11种蛋白质中的7种（CCR6、HLA-DPA1、HLA-DRB1、IFNGR2、C5、ATP2A1和FEN1）显示出与RA共定位的有力证据（PP.H4>0.8），并且可能是候选药物靶基因。
4.PheWAS
为了进一步评估所鉴定的七个潜在药物靶基因对其他性状是否有有益或有害的影响，以及是否存在MR Egger截距试验未捕捉到的潜在多效性，本研究使用阿斯利康PheWAS门户数据库中的17361个二分表型和1419个定量表型在基因水平上进行PheWAS。PheWAS结果可以解释为遗传确定的蛋白质表达与特定疾病或性状的关联。如表2，除ATP2A1外，六个药物靶点均未在基因水平上与其他性状显著相关（基因组相关性P＜5E−8），这表明作用于这些靶点的药物的潜在副作用以及这些基因中水平多效性的存在可能很小，进一步表明了本研究结果的可靠性。相反，ATP2A1与握力呈正相关，与手臂阻抗呈负相关，这表明作用于ATP2A1基因的RA药物可能影响这两个性状，并且ATP2A1的MR分析可能对结果产生多效性影响。
5.富集分析
GO富集分析通常用于显示基因和术语之间的相互作用，而KEGG富集分析可以说明基因和功能途径之间的关系。如图6所示，5，BP类别中最重要的途径都与干扰素-γ有关（干扰素-γ介导的信号通路、细胞对干扰素-γ的反应、对干扰素-γ的反应）。在CC类中，药物靶基因同样富含免疫和内质网相关成分（MHCII类蛋白质复合体，MHC蛋白质复合体，整合内质网腔侧的成分内质网膜腔侧和内质网膜的管腔侧），这与先前的研究一致。此外，就MF而言，这些基因还参与与免疫密切相关的功能（免疫受体活性、MHC II类受体活性、肽抗原结合、细胞因子受体活性和抗原结合）。如图6所示，KEGG富集分析的前三种途径是炎症性肠病（IBD）、利什曼病、T1和T2细胞分化，其中IBD是一种自身免疫性疾病。IBD是一种自身免疫性疾病，利什曼病是一种由寄生虫感染引起的疾病，这三种疾病都与免疫反应密切相关。
6.PPI网络
七个药物靶基因被加载到字符串中(https://cn.string-db.org/)用于网络创建的数据库，并将得到的肉导入Cytoscape中进行可视化。图7描述了在50节点、375边缘PPI网络中七种药物靶标与其他蛋白质的相互作用。
对于使用GeneMANIA构建的PPI网络(https://genemania.org/)，除了7个药物靶标外，该网络还包括另外20个潜在相互作用基因，共490个相互作用环节（图8）。这些连接包括共表达（84.47%）、常见蛋白质结构域（9.90%）和物理相互作用（5.63%）。网络的功能分析描述了药物靶点和相关基因的作用及其功能。网络功能分析显示与先前的富集分析结果相似，均显示出较强的免疫功能相关性，与RA的自身免疫性疾病性质一致。
7.候选药物预测
DSigDB数据库在本研究中用于预测潜在有效的干预药物。根据调整后的p值，显示了前10个潜在化合物（表3）。结果表明，大黄酸（Rhein TTD 00010611/CTD 00001002）和酪氨酸磷酸化抑制剂（Tyrphostin AG 538 TTD 00011608）是与FEN1和CCR6相关的两种最显著的药物。相反，槲皮素（槲皮素CTD 00006679）和砷（arsenic CTD 00005442）与大多数基因相互作用。
8.分子对接
为了评估候选药物对其靶点的敏感性，并由此了解药物靶点的可药用性，本研究进行了分子对接。Autodock Vina v.1.2.2用于获得frst-fve候选药物与相应基因编码的蛋白质的结合位点和相互作用，并产生每次相互作用的结合能，从而产生总共七种蛋白质与药物的有效对接结果（表4和图9）。每种候选药物都通过可见的氢键和强静电相互作用与蛋白质靶点相连。此外，每个靶标的结合口袋被四种候选药物成功占据。C5和槲皮素的结合能最低（−9.364 kcal/mol），表明结合极为稳定。
这些结果表明，本研究中提出的RA药物靶点与RA密切相关，具有很高的药用价值，有望设计针对这些基因的RA治疗方法。
本研究优势
首先，这是利用迄今为止最大的公开RA风险GWAS的数据，首次使用MR来确定RA药物靶点。此外，复制不是MR分析中的常规技术，但这项研究在两个大的队列中复制了MR结果，需要基因在两个GWAS中都达到显著水平。为了将队列用作药物靶基因，验证了结果的稳健性，并大大降低了假阳性的可能性，这可以进一步提高临床试验的成功率。富集分析阐明了这些基因的功能特性以及这些药物靶基因通过PPI的调节关系，为通过旁路开发RA药物提供了潜在的可能性。药物预测说明了这些基因的药用潜力，分子对接的高结合活性表明了这些基因作为药物靶点的强大潜力。本研究包含了从鉴定到药物结合特性的完整评估，提出了RA的七个药物靶点，并提供了有力的证据。
本研究局限性
孟德尔随机化为因果关系提供了有价值的见解；然而，它假设了低剂量药物暴露以及暴露和结果之间的线性联系，这可能无法完全复制现实世界中的临床试验，在这些试验中，高剂量通常在短时间内进行评估。因此，MR结果可能无法准确反映在实际临床环境中观察到的缺陷大小，也可能无法完全反映预测药物的影响。
另一个限制来自研究队列的多样性。虽然eQTL分析包括非欧洲血统的个体，但类风湿性关节炎（RA）人群仅由欧洲人组成。考虑到遗传背景和连锁不平衡模式的差异，这种群体背景的差异可能会在MR效应估计中引入潜在的偏差。
此外，MR检测对血液eQTL的依赖对确定最有效的治疗组织提出了挑战。不同的组织可能具有不同的遗传调控机制，仅关注血液eQTL可能无法全面了解该疾病及其潜在的治疗方法。
这项研究的可推广性受到其主要包括欧洲后裔的限制。将结果外推到其他种族的个人需要进一步的研究和验证，以确保结果具有更广泛的适用性。尽管为了最大限度地减少偏差，MR分析仍然容易受到无法测量的因素或多效性的影响，这可能会影响结果。必须承认这些局限性及其对研究结论的潜在影响。
此外，该研究主要关注顺式eQTL及其与类风湿性关节炎的关系，可能忽略了导致该疾病复杂性的其他调节元件和环境因素。富集分析虽然有价值，但有其固有的局限性，因为它依赖于预先定义的基因集或途径，而这些基因集或通路可能不包括所有可能的生物机制或相互作用。缺乏显著富集并不一定意味着缺乏生物学相关性，研究人员应谨慎解释结果。
最后，分子对接分析的准确性在很大程度上取决于蛋白质结构和配体的质量。虽然这种方法可以识别潜在的药物靶点，但不能保证它们在临床环境中的有效性。后续的实验验证和临床试验是必要的，以确认已识别靶点的治疗潜力。
总之，本研究利用MR分析来确定类风湿性关节炎（RA）的潜在药物靶点。发现7个药物靶点在这两种药物中都具有重要作用队列，并得到共同定位分析的支持。这些基因与免疫功能有关成为RA有效治疗靶点的潜力。此外，药物预测和分子对接用于验证这些靶标的药用价值。这些有希望的发现为更有效的RA治疗提供了线索，有可能降低药物开发成本并推进个性化的药物方法。这项研究为feld做出了宝贵的贡献，强调这些已确定目标的重要性在RA治疗中。有必要对靶向这些基因的药物进行进一步的研究和临床试验。
转自：“朗盟医学”微信公众号
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