英文原题：Unveiling the Crucial Roles of O₂•− and ATP in Hepatic Ischemia–Reperfusion Injury Using Dual-Color/Reversible Fluorescence Imaging
通讯作者：张雯，山东师范大学；吴庐陵，巴斯大学；Tony D. James，巴斯大学；李平，山东师范大学；唐波，山东师范大学
作者：Jihong Liu, Wen Zhang*, Xin Wang, Qi Ding, Chuanchen Wu, Wei Zhang, Luling Wu*, Tony D. James*, Ping Li*, and Bo Tang*
研究背景
肝脏缺血再灌注损伤（HIRI）是肝脏切除手术和肝脏移植手术中不可避免的并发症，是术后肝功能障碍和肝功能衰竭的主要原因。在HIRI发展进程中，加剧的氧化应激与受损的能量代谢协同作用，共同在肝损伤中发挥重要作用。超氧阴离子（O₂•−）和三磷酸腺苷（ATP）分别为氧化应激和能量代谢相关的关键生物标志物。然而，由于缺乏合适的原位成像工具，O₂•−和ATP在HIRI中的时空波动以及它们如何协同参与HIRI的病理机制目前尚不清楚。现有的O₂•−或ATP响应型荧光探针由于其不可逆机制，不适合动态监测HIRI过程中O₂•−和ATP的水平变化。因此，迫切需要开发一种荧光探针，能够在HIRI过程中同时、可逆地检测O₂•−和ATP，这不仅能够监控HIRI过程中O₂•−和ATP的时空、动态变化，而且有望揭示O₂•−和ATP在HIRI中的相关性及调控机制。
成果简介
基于以上背景，山东师范大学唐波教授/李平教授课题组发展了一种双色双可逆分子荧光探针(UDP)用于HIRI过程中O₂•−和ATP的实时、动态和同步可视化，并揭示了它们在HIRI中的相互关系和协同作用。该成果以“Unveiling the Crucial Roles of O₂•− and ATP in Hepatic Ischemia−Reperfusion Injury Using Dual-Color/Reversible Fluorescence Imaging”为题发表在国际权威杂志Journal of the American Chemical Society上。该项研究工作也是唐波教授/李平教授课题组于2022年在Journal of the American Chemical Society（J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 1, 174–183; J. Am. Chem. Soc., 2022, 144, 30, 13586–13599）上发表关于药物诱导的肝损伤ONOO⁻和ATP的单/双光子成像与NIR-Ⅱ荧光引导HIRI的精准导航工作之后，在肝损伤研究方面取得的又一个突破性研究结果。文章第一作者是山东师范大学博士研究生刘继红，山东师范大学张雯副教授、巴斯大学吴庐陵博士、Tony D. James教授、山东师范大学李平教授和唐波教授为论文共同通讯作者。
本文中，作者报道了一种兼具双色和双可逆性质的荧光探针（UDP），UDP对O₂•−和ATP的响应具有优异的灵敏度、选择性和可逆性，这使得UDP能够在蓝色和红色荧光通道中独立响应O₂•−和ATP水平变化，没有光谱串扰。UDP在HIRI过程中的原位成像首次揭示了肝细胞和小鼠肝脏的同步O₂•−爆发和ATP消耗。作者揭示了HIRI过程中细胞内的O₂•−—琥珀酸脱氢酶（SDH）—线粒体内的还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联信号通路，首次阐明了O₂•−和ATP在HIRI过程中的关联性。这项工作证实了UDP在动态监测HIRI和揭示HIRI发病机理的巨大潜能。
图1 UDP的结构和荧光性质。（A）UDP响应O₂•−和ATP的可逆发光机制。为了构建O₂•−和ATP双可逆响应的荧光探针，咖啡酸与罗丹明B分别作为O₂•−和ATP特异性的识别基团和相应的荧光团，二者通过二乙烯三胺连接。作为常用的O₂•−清除剂，咖啡酸被用作O₂•−高特异性的识别基团，O₂•−特异性氧化咖啡酸中的对苯二酚基团生成苯醌，从而促进蓝色荧光的产生。修饰二乙烯三胺的罗丹明螺内酰胺衍生物由于具有多个氨基，已被证明是ATP高灵敏和选择性的响应位点。咖啡酸基团与O₂•−的反应过程和罗丹明螺内酰胺部分与ATP的结合作用均具有可逆性，有望动态追踪O₂•−和ATP水平变化。（B）UDP响应不同浓度O₂•−的荧光光谱。（C）UDP在470 nm处的荧光强度与O₂•−水平的关系。（D）UDP的O₂•−通道对常见干扰物质的选择性。（E）UDP响应不同浓度ATP的荧光光谱。（F）UDP在588 nm处的荧光强度与ATP水平的关系。（G）UDP的ATP通道对常见干扰物质的选择性。
图2 UDP的可逆性、光谱串扰和生物毒性评价。（A）添加O₂•−(65 μM)和GSH(200 μM)后，UDP蓝色荧光的可逆响应循环。（B）在22 mM ATP存在下，加入不同浓度的O₂•−(0-65 μM)后，UDP在O₂•−通道的荧光光谱。（C）与65 μM O₂•−和22 mM ATP反应前后UDP的吸收光谱。（D）添加ATP(22 mM)和三磷酸腺苷双磷酸酶(1 U/N)后，UDP红色荧光的可逆响应循环。（E）在65 μM O₂•−存在下，加入不同浓度的ATP(0-22 mM)后，UDP在ATP通道的荧光光谱。（F）UDP的生物毒性评估。
图3 2-甲基雌二醇（2-ME）或寡霉素A（Omy A）刺激肝细胞中O₂•−和ATP波动的共聚焦荧光成像。（A）2-ME（O₂•−刺激剂）和钛铁试剂（O₂•−清除剂）处理的肝细胞O₂•−（蓝色通道，λex = 405 nm, λem = 420-490 nm）和ATP（红色通道，λex = 514 nm, λem = 525-668 nm）的共聚焦荧光成像。（B）Omy A（ATP抑制剂）和ATP处理的肝细胞O₂•−和ATP的共聚焦荧光成像。(C, D)分别为(A, B)的相对蓝色和红色荧光强度输出。
图4 HIRI全过程中肝细胞O₂•−和ATP波动的动态可视化及HIRI药物NAC的干预效果。（A）缺血0分钟、20分钟、40分钟，缺血40分钟后再灌注20分钟、缺血40分钟后再灌注40分钟以及0.5 mM、1 mM NAC预处理组肝细胞对O₂•−(蓝色通道，λex = 405 nm， λem = 420-490 nm)和ATP(红色通道，λex = 514 nm， λem = 525-668 nm)进行荧光成像。(B, C) A图的相对蓝色和红色荧光强度输出。(D) ROS含量测定试剂盒测定HIRI不同时期的相对ROS水平。(E) ATP含量测定试剂盒测定HIRI不同时期的ATP水平。
图5 HIRI期间小鼠肝脏中O₂•−和ATP动态的实时可视化。(A)操作示意图。(B)缺血0分钟、缺血20分钟、缺血40分钟及缺血40分钟再灌注20分钟、缺血40分钟再灌注40分钟小鼠肝脏中O₂•−(蓝色通道，λex = 405 nm， λem = 420-490 nm)和ATP(红色通道，λex = 514 nm， λem = 525-668 nm)的荧光成像。(C, D) B图的相对蓝色和红色荧光强度输出。
图6 通过LC-MS/MS分析琥珀酸脱氢酶与O₂•−反应的蛋白质组学。(A) C68, M71的氧化。(B) W47的氧化。(C) H57的氧化。(D) W218的氧化。*和红色表示的残基代表O₂•−的修饰位点。
图7 HIRI过程中细胞内的O₂•−—SDH—线粒体内的NADH—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联信号通路。（A）经不同处理的肝细胞的SDH活性分析。（B-C）经不同处理的肝细胞线粒体NADH含量。（D）经不同处理的肝细胞线粒体ATP含量。（E）在3-NPA作用下，使用UDP荧光成像肝细胞ATP。(F) E图的相对红色荧光强度输出。（G）经不同处理的肝细胞细胞ATP含量。（H）HIRI过程中细胞内的O₂•−—SDH—线粒体内的NADH—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联信号通路。
本文成功开发了一个对O₂•−和ATP具有高灵敏度和卓越选择性响应的双色双可逆的分子平台（UDP）。UDP能够同时、可逆响应O₂•−和ATP，并且独立监控蓝色和红色通道内的荧光，而不受光谱串扰的影响。得益于探针在体外响应O₂•−和ATP出色的性能，UDP成功被用于同时成像与动态监测肝细胞内源性的O₂•−和ATP水平。通过分离良好的蓝、红光，UDP进一步被用来实时、原位可视化HIRI全过程中肝细胞内O₂•−和ATP及HIRI药物的干预效果。更重要的是，UDP成功实现了HIRI过程中小鼠肝脏内O₂•−和ATP的可视化。最后，本文首次揭示了HIRI过程中细胞内的O₂•−—SDH—线粒体内的NADH—线粒体内的ATP—细胞内的ATP级联介导的信号通路。这项工作报道了首个研究HIRI中O₂•−和ATP之间相关性和协同作用的荧光探针，有望为深入了解HIRI进展中相互联系的活性分子之间的相互作用提供多种机会。
通讯作者简介
张雯副教授，山东师范大学
张雯，分析化学专业博士，山东师范大学副教授，硕士生导师。2015年进入山东师范大学化学化工与材料科学学院。主要从事功能小分子荧光探针的设计合成，并探索其在生物传感与成像领域的应用研究。以第一或通讯作者身份在J. Am. Chem. Soc.，Angew. Chem. Int. Ed.，Chem. Sci.，Anal. Chem.，Chem. Commun.等国际重要的学术刊物上面发表论文10余篇。
吴庐陵博士，英国巴斯大学（右）；Tony D. James教授，英国巴斯大学（左）
吴庐陵，英国巴斯大学博士。博士由国家留学基金委和英国巴斯大学共同资助。2022年至2023年在西湖大学进行博士后研究，期间获得博士后国际交流计划引进项目。2023年在巴斯大学从事由英国工程与自然科学研究理事会（EPSRC）资助的博士后研究。主要研究方向是基于多种逻辑与双重响应策略，发展针对多种目标物的同时成像分析方法；开发基于无苯环荧光团（薁）的探针。目前以第一或共同通讯作者在J. Am. Chem. Soc.、Nat. Rev. Chem. 等杂志发表论文26篇。参编英文专著一本，并撰写其中一个章节。担任JACS Au, Chem. Rev., Chem. Sci. 等期刊的审稿人，以及Biosensors期刊的客座编辑。
Tony D. James教授，英国巴斯大学化学系教授，英国皇家化学学会会员。1986年于英国东安格利亚大学获得学士学位，1991年于加拿大维多利亚大学获得博士学位，1991到1995年期间于日本Shinkai教授课题组做博士后，1995到2000年期间于英国伯明翰大学任皇家学会研究员。2013年因对日本和英国科研合作做出的杰出贡献获得了达亿瓦-艾德里安奖。长期从事分子识别，分子组装，荧光探针方面的研究，是糖识别及超分子化学方向的国际知名专家。Tony D. James教授已出版三本专著，在Nature, Nat. Chem., Chem. Rev., Chem. Soc. Rev., JACS和Angew. Chem. Int. Ed.等国际学术期刊上发表443余篇学术论文，此外拥有25项国际专利。
https://researchportal.bath.ac.uk/en/persons/tony-james
李平教授，山东师范大学
李平，山东师范大学二级教授、博士生导师，享受国务院政府特殊津贴、入选百千万人才工程国家级人选、国家有突出贡献中青年专家、泰山学者、教育部“长江学者和创新团队发展计划”创新团队带头人、教育部“全国高校黄大年式教师团队”骨干成员、山东省有突出贡献的中青年专家、山东省优秀研究生导学团队负责人、山东省高校重点实验室首席专家、山东生物医学工程学会专业委员会委员、山东省科协国家级科技思想库决策咨询专家、AIMS Materials Science编委、中国致公党山东师范大学基层委员会副主委。李平教授多年来致力于新型光学功能探针的构建，以及细胞与活体内生物活性分子化学成像的研究工作，取得了一系列重要突破和研究进展。已主持完成国家重点基础研究发展计划（“973计划”）课题1项、国家自然科学基金面上项目3项、国家重大新药创制课题子课题1项、国家自然科学基金青年基金1项、山东省自然科学基金重大基础研究项目1项及山东省科技攻关项目1项。目前主持国家自然科学基金面上项目1项。相关研究成果已在Chem. Soc. Rev.、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem. Int. Ed.、Chem. Sci.、Anal. Chem.、Chem. Commun.等国际重要的学术刊物上面发表论文80余篇，其中影响因子5.0以上70余篇，10.0以上20余篇，论文总引用达3000余次。作为主要参与者完成的项目，先后荣获国家自然科学二等奖（3/5）、国家科技进步二等奖（8/10），山东省自然科学一等奖（2/4）、山东省自然科学二等奖（1/4）、山东省科技进步一等奖（5/8）、山东省青年科技奖以及山东高等学校优秀科研成果二等奖（1/3）等。此外，李平教授还曾获山东省教育系统女职工建功立业标兵、齐鲁最美教师——山东省教书育人楷模、山东省省级教学成果奖一等奖（9/10）、山东师大研究生教育教学成果奖一等奖（9/10）、山东师大优秀教学奖及“青年教学能手”等荣誉称号。
http://www.lipinglab.com/
唐波教授，山东师范大学
唐波，汉族，1964年11月生，中共党员，1994年毕业于南开大学化学系，获理学博士，化学化工与材料科学学院教授、博士生导师，南开大学兼职教授，山东大学兼职博士生导师，教育部科技委学部委员，首届十佳全国优秀科技工作者提名奖获得者（山东省唯一），973计划首席科学家，国家杰出青年科学基金获得者，“新世纪百千万人才工程”国家级人选，入选“泰山学者攀登计划”，是国家自然科学基金委员会第12、13届专家组成员，农药、医药中间体清洁生产教育部工程研究中心主任，“分子与纳米探针”教育部重点实验室主任，山东省“十二五”分析化学特色强化重点学科负责人，山东省“十二五”高等学校强化建设太阳能化学转化与储存重点实验室学术带头人，山东省精细化学品清洁合成重点实验室学术带头人；山东师范大学省级化学学科带头人、分析化学学科带头人，化学博士学位授权一级学科负责人，化学博士后科研流动站负责人，他所领导的团队是教育部“长江学者和创新团队发展计划”创新团队和山东省优秀创新团队。现主要从事分子及纳米荧光探针的合成及其在生物成像中的应用、绿色化工、荧光材料合成及太阳能化学转化与储存等方面研究工作。在理论研究领域，在Nat. Commun., J. Am. Chem. Soc., Angew. Chem. Int. Ed., Nano Lett., ACS Nano, Adv. Funct. Mater., Anal. Chem., Biomaterials, Lab Chip, Chem. Commun.等杂志发表SCI论文500余篇，影响因子大于5.0的300余篇，引用达20000余次，荣获国家自然科学二等奖1项，山东省自然科学奖一等奖1项。在应用研究方面，申请国家发明专利44项，已授权31项；荣获国家科技进步奖二等奖2项，山东省科技进步奖一等奖2项、技术发明奖一等奖1项。在国内建立高新技术产业化基地与合作基地6个，研制与开发产品40余种，取得了显著的经济效益与社会效益。唐波的研究成果引起了国内外的广泛关注，多次参加国内外学术会议，进行学术交流。主持国家重点基础研究发展计划（973）、国家自然科学基金重点项目、国家自然科学基金科学仪器基础研究专项等多项国家级项目。
http://www.tangb.sdnu.edu.cn/index.htm
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
