英文原题：Insights into chain elongation mechanisms of weak electric field stimulated continuous caproate bio-synthesis: key enzymes, specific species functions and microbial collaboration
通讯作者：郭婉茜，哈尔滨工业大学
作者：Weitong Ren, Qinglian Wu, Lin Deng, Huazhe Wang, Yifeng Zhang, Wanqian Guo*
近日，哈尔滨工业大学郭婉茜教授团队构建了弱电场强化己酸生物合成体系，有效提高己酸产率，解析了混菌连续流反应器中的碳链延长机理，揭示了微生物在弱电场刺激下的协作机制，为己酸生物合成提供了一种前景广阔的策略。
随着化石燃料的过度使用和温室气体（GHG）的大量排放，碳减排变得越来越重要，推动了对负碳排放技术的需求。其中，从废弃生物质中通过链延长（chain elongation，CE）技术生产中链脂肪酸（medium chain fatty acids，MCFAs），因其高能量含量和利用价值而被广泛研究，目前MCFAs主要通过化学合成方法获得，通过生物合成将会缓解化学合成所带来的能源成本和环境问题。在 MCFAs 家族中，己酸（C6）因其传统来源少、应用范围广而受到更多关注。然而，己酸产量低是CE技术应用的一个瓶颈，需要开发己酸高效生产的方法，尤其是在连续流反应器中实现己酸高效合成对工程应用的意义重大。
为了解决上述问题，哈尔滨工业大学郭婉茜教授团队通过向连续流CE反应器中施加弱电场，将己酸产率有效提高21%，并且通过比较施加电场与不施加电场CE反应器中微生物关键酶基因丰度的变化，揭示电场对CE反应过程关键酶的影响。通过分析微生物关键种丰度和功能变化，阐明了电场对微生物功能的影响和电场促进己酸生物合成过程中的微生物协作机制。
图1：电场促进己酸产率、碳通量、电子传递效率和选择度提高
如图1所示，在无电场的R1中，检测到的己酸最大浓度为2.71 g/L（5.99 g COD/L），在外加电场的R2中，施加的0.05 v低强度电场可使己酸浓度提高21%，达到3.28 g/L（7.24 g COD/L）。随着己酸的积累，可能会出现负反馈抑制作用，从而阻止己酸产量的继续增加，而电场的加入可能有助于克服这种抑制作用。据我们所知，我们的最大己酸产率在以乳酸为底物的研究中处于较高水平，性能甚至可与外加液液萃取的反应器相媲美，电场确实使己酸生物合成过程更加高效，这对工程应用至关重要，可降低生产成本并提高经济效益。
图2： 外加电场下链延长途径中的关键酶基因丰度变化
外加电场作用下，底物乳酸转化为CE反应的关键中间产物丙二酰辅酶A和底物乙酸转化为CE反应关键中间产物乙酰辅酶A过程的关键基因丰度均有所提高，说明电场促进了底物转化，这导致更多的中间产物被产生进入后续反应过程。在CE反应过程中，碳链延长反应途径主要有两种，一种是逆β氧化途径（reverse beta-oxidation，RBO），另一种是脂肪酸合成途径（fatty acid biosynthesis，FAB），两种途径中关键基因丰度变化也被研究。其中RBO途径的关键酶基因并没有显著的增加，然而FAB途径的关键酶基因丰度有明显增加，尤其是脂肪酸合成酶（Fatty acid synthase, bacteria type (EC:2.3.1.-, FAS)），这表明电场促进了FAB途径的作用，进而提高己酸合成。
图3：电场作用下能量代谢和跨膜运输系统功能
己酸合成的CE反应过程涉及有机物跨膜运输和能量代谢，而这些过程有可能成为己酸合成的限速步骤。通过宏基因组分析可知，转运系统相关的基因如转运系统底物结合蛋白(rbsB, ABC.MS.S)，膜蛋白(bmpA, bmpB, bmpC)和磷酸盐转运系统底物结合蛋白(pstS, phnD)等，这些膜转运蛋白可以控制小分子有机或无机物质的转运，从而为微生物内部的CE反应提供支持，相关基因丰度的提高可能说明电场会提高物质转运的能力。除此之外，能量代谢系统相关的酶基因（nuoA, nuoE, nuoF, nuoG, nuoK和Rnf等），在电场作用下丰度也有所提高。总之，电场增强了跨膜运输和能量代谢的活性，从而提高了己酸的产量。
图4：外加电场下微生物物种与功能分析
PCoA分析显示了不同反应器污泥在微生物种水平上的微生物组成差异（图4（a）），外加电场的污泥微生物与无电场污泥微生物样本具有不同的微生物群落结构演替。相似性分析（ANOSIM）用于检验组间差异是否显著大于组内差异（图4（b）），结果显示组间距离等级明显大于组内，R值为1，表明了两组反应器微生物在种水平下的微生物差异性。Student's t 检验表明两个反应器微生物的物种分布存在显著差异（图4（c）），尤其是Candidatus_Pseudoramibacter_fermentans和Ruminococcaceae_bacterium_CPB6， 并且在外加电场存在条件下 Candidatus_Pseudoramibacter_fermentans的丰度由7.88% 下降到 4.06%，而Ruminococcaceae_bacterium_CPB6的丰度则由1.04% 升高到 7.16%（Figure S5），进一步分析表明在电场作用下，与 CE 相关的微生物在种水平上相对丰度总和从 20.13% 增加到 24.16%，这也是己酸产率提高的原因。
图5：有无电场时特定物种功能变化
大部分与Ruminococcaceae_bacterium相关的功能基因丰度最高（图5（b）），这表明该微生物种在底物转化过程、RBO途径、FAB途径以及跨膜运输和能量代谢中发挥着重要的作用，然而仍有一些关键基因在该种中没有检测到，这意味着单个菌种无法完成己酸的合成。其他一些微生物种的功能受到电场的影响也会发生变化，例如Ruminococcaceae_bacterium_CPB6，当施加电场时，与 RBO 途径相关的 ACAT、与 FAB 途径相关的 FAS 和 ACACA 被检测到，与能量系统相关的基因（ATPV、rnf 和 nuo（p 值均小于 0.001））的丰度显著提高，表明电场提高了Ruminococcaceae_bacterium_CPB6的功能。也有微生物的功能在外加电场条件下被抑制，例如Sinirhodobacter_huangdaonensis，可见电场对微生物功能的影响是双面的，对不同的微生物可能起到不同作用，但总体上电场对微生物产己酸起到促进作用。
图6：外加电场下CE反应微生物协作机制
虽然上文提到Ruminococcaceae_bacterium功能基因是最完整的，但关键功能基因的缺失阻碍了CE过程的整合，因此需要其他物种来补充缺失的功能基因，并通过其他不同物种功能基因产生的中间产物的运输来完成反应,如图6所示。在电场存在条件下，Firmicutes_bacterium 菌种弥补了两个关键功能基因aceF和fadN，而pdhB和atoD基因则由Pseudomonas_aeruginosa补充，特别是atoD，它是 RBO 途径中不可或缺的酶，只在该物种中检测到。同样，lcdA也只在Candidatus_Neoanaerotignum_tabaqchaliae中检测到，它是一种负责将乳酸转化为丙二酰辅酶A的关键酶。总之，宏基因组分析进一步证明，在电场作用下CE 过程中的微生物协作机制是通过不同物种之间功能互补的基因和关键过程中间产物的运输来实现的。
相关论文发表在ACS ES&T Engineering上，哈尔滨工业大学博士研究生任韦同为论文的第一作者，哈尔滨工业大学郭婉茜教授为该论文的通讯作者。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
如有侵权，请联系本站删除！
