英文原题：Single-Nucleotide Resolution Mapping of N6-Methyladenine in Genomic DNA
通讯作者：Weimin Ci (慈维敏), Yinsheng Wang (汪寅生), Bi-Feng Yuan (袁必锋)
作者：Cheng-Jie Ma (马铖杰), Gaojie Li (李高杰), Wen-Xuan Shao (邵文铉), Yi-Hao Min (闵奕豪), Ping Wang (王平), Jiang-Hui Ding (丁姜慧), Neng-Bin Xie (谢能彬), Min Wang (王敏), Feng Tang (唐峰), Yu-Qi Feng (冯钰锜), Weimin Ci (慈维敏)*, Yinsheng Wang (汪寅生)*, Bi-Feng Yuan (袁必锋)*
背景介绍
N6-甲基腺嘌呤（6mA）是一种天然的DNA修饰，在原核生物和真核生物DNA中广泛存在。6mA在胚胎发育、肿瘤发生和线粒体应激适应中发挥重要作用。全面揭示6mA的功能需要对其在DNA中的位置进行精确绘制。然而，在传统的高通量测序中，无法区分dA和6mA，因此6mA的定位分析具有挑战性。武汉大学袁必锋教授、加州大学河滨分校汪寅生教授以及中科院北京基因组所慈维敏教授合作，利用人工改造的脱氨酶，开发了DNA中6mA的单碱基分辨率定位分析新方法。这项研究成功地实现了对细菌基因组和哺乳动物线粒体DNA中6mA的单碱基分辨率定位分析。
文章亮点
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鉴定了一种腺嘌呤脱氨酶突变体ABE8e能够特异性催化DNA中腺苷dA脱氨基转变为肌苷dI，而6mA上的甲基修饰能够抑制ABE8e的脱氨基作用。
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基于ABE8e的特性，建立了ABE8e介导的DNA中6mA单碱基分辨率测序方法（DM-seq），实现了细菌基因组和哺乳动物线粒体DNA中6mA的单碱基分辨率定位分析。
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DM-seq方法简单、假阳性率低、反应条件温和，只需要纳克级别的DNA即可进行测序文库构建。
图文解读
图1. DM-seq方法的原理以及通过单克隆测序进行评价。
首先，研究团队成功地表达并纯化了重组ABE8e蛋白。经过ABE8e蛋白的处理，DNA链上的dA会发生脱氨基反应，转变为dI。由于dI和dC之间能够配对，所以在测序中，这些转化后的dI会被读取为鸟嘌呤G。然而，DNA链上的6mA甲基修饰并不会被脱氨基，因此在测序时仍然被读取为A（图1A和1B）。通过使用单克隆测序技术，研究团队定量分析了这种转化反应的效率。结果显示，A-to-G转化率达到了99.7%（图1C），并且不同序列中的腺苷都能够被有效地脱氨基，脱氨效率高于98.7%（图1D）。
图2. 大肠杆菌基因组DNA中6mA的定位分析。
接下来，研究团队利用建立的DM-seq方法对野生型大肠杆菌K12和dam缺陷型大肠杆菌SCS110中的6mA进行了定位分析。经过ABE8e处理后，大肠杆菌DNA中的dA能够有效地转化为dI，而6mA则不受影响（图2A）。通过高通量测序后，对所得数据进行基序分析发现，6mA主要出现在GATC序列中（图2B），而且不同生物学平行样品之间的6mA位点高度相关（图2C）。然而，在缺乏dam基因的SCS110菌株中发现的6mA位点分布更为随机（图2C）。在野生型K12菌株中，检测到约38000个6mA位点，并且这些位点上的GATC序列完全被甲基化；而在SCS110菌株中，仅观察到约200个6mA位点（图2D、2E）。通过Sanger测序验证了三个大肠杆菌DNA中GATC序列中的6mA位点（图2G），这表明DM-seq方法对于定位6mA的准确性较高。
图3. 哺乳动物线粒体DNA中6mA的定位分析。
进一步使用DM-seq方法，研究团队对哺乳动物HepG2细胞线粒体DNA中的6mA分布进行了分析。最终确定了17个6mA位点，这些位点都位于线粒体DNA的重链上（图3）。研究结果表明，DM-seq方法能够准确地定位线粒体DNA中的6mA。
总结与展望
本研究开发了一种名为DM-seq的腺嘌呤脱氨酶介导的DNA中6mA单碱基分辨率测序方法。利用该方法，成功地对大肠杆菌基因组DNA和哺乳动物线粒体DNA中的6mA进行了单碱基分辨率的定位分析。DM-seq方法简单易行，对于揭示生物体中6mA的新功能具有很好的价值。未来，可以进一步应用DM-seq方法来研究其他生物体中6mA的分布和功能，探究6mA在基因调控、表观遗传学和疾病发生发展中的作用。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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