红细胞（RBC）是人体内含量最多的细胞类型。红细胞因其独特的生物学特性而被广泛研究作为体内药物递送系统。红细胞缺乏细胞核，在血管内循环，寿命为120天，其良好的生物相容性和较大的表面积体积比使红细胞成为携带多种药物分子的理想囊泡。
之前的研究已经探索了几种使用红细胞进行药物递送的方法。一种方法是利用渗透压瞬时打开细胞膜并将药物包裹起来进行持续释放，但这种方法会破坏细胞膜，从而限制了其长期治疗效果。另一种方法是使用非共价键（例如抗原-抗体结合）将药物附着在红细胞表面，但这些药物可能在进入人体后不久就与细胞表面分离，使其难以达到持久治疗效果。第三种方法是将药物吸附到红细胞表面，但这种方法同样受到非共价结合的限制，导致药物在几分钟至几小时内从细胞上分离。
近日，西湖大学高晓飞团队在 Cell Research 期刊发表了题为：Development of a highly-efficient erythrocyte-drug covalent conjugation platform and its use in treating thrombotic disorders 的研究论文。
该研究开发了一种高效的红细胞-药物共价结合平台，并在临床前研究中验证了该平台在预防和治疗血栓性疾病中潜力。
在这项研究中，高晓飞团队的目标是开发一种有效的方法，直接设计天然红细胞用于药物递送。
细菌分选酶是能够以共价和位点特异性方式修饰蛋白质的转肽酶。来自金黄色葡萄球菌的分选酶A（wt SrtA）识别LPXTG基序并在苏氨酸和甘氨酸残基之间切割形成共价酰基-酶中间体。这种中间体由细胞表面的N端3×甘氨酸残基分解，同时在底物和细胞之间形成肽键。SrtA可将多肽共价偶联到红细胞表面，但这种方法需要从过表达LPXTG基序膜蛋白的造血干/祖细胞构建红细胞。因此，SrtA的使用受到底物基序的严格要求的限制。
为了克服这一限制，研究团队探索了SrtA突变体（mg SrtA）的使用，该突变体已被证明可以识别N端有一个甘氨酸（1×甘氨酸）修饰的多肽。与野生型SrtA（3×甘氨酸）相比，mg SrtA在底物识别方面的限制降低，增加了与天然存在于红细胞表面的膜蛋白偶联的可能性。为了测试mg SrtA的效率，研究团队使用了一种生物素-LPETG肽，发现mg SrtA成功地催化了生物素-LPETG肽与人红细胞表面的结合。
虽然mg SrtA可以有效地偶联小分子或多肽，但由于mg SrtA催化的转肽化反应的可逆性，其偶联蛋白质的效果并不理想。需要较高的蛋白质浓度来偶联足够量的有效载荷以供进一步应用。
因此，研究团队设计了一种策略，将修饰后的Linker添加到有效载荷中。首先，将LPETG基序中的苏氨酸和甘氨酸残基之间的酰胺键替换为2-羟基乙酸，通过一个酯键进行修饰，这种修饰可以有效地减少SrtA的逆反应。
实验结果表明，生物素-LPET*G（*代表2-羟基乙酸）的偶联效率显著高于未修饰的生物素-LPETG。此外，还通过在C端添加半胱氨酸来修饰蛋白质的有效载荷。与eGFP-LPETG相比，添加了不可逆Linker的eGFP-LPET*G显著改善了结合效果。
然后，研究团队在小鼠体内追踪了这些红细胞结合物的体内稳定性，结果显示生物素-红细胞和eGFP-红细胞的寿命与天然红细胞相当。
在建立了这个有效的红细胞-药物偶联平台后，研究团队进一步探索了这种方法的药理学潜力。
据估计，全世界有1/4的死亡与血栓性疾病有关。血管内血栓形成可导致严重疾病，例如深静脉血栓形成（DVT）和肺栓塞（PE）。血栓形成后的标准治疗是给予一类纤溶酶原激活剂，例如尿激酶型纤溶酶原激活剂（uPA）或组织型纤溶酶原激活剂（tPA）。
uPA分子以非活性单链酶原或尿激酶原（pro-uPA）的形式分泌，在血栓形成过程中被水解，然后激活纤溶酶原形成纤溶酶。因此，研究团队使用pro-uPA作为红细胞结合药物开发的概念验证。使用上述红细胞-药物偶联平台，研究团队实现了800倍的载药量增加，在每个红细胞上检测到3.00×10E4拷贝的pro-uPA-cys-LEPT*G拷贝。此外，通过多光谱成像流式细胞术和显微形态学分析表明，修饰后的红细胞具有与天然红细胞相似的形态和溶血率。
接下来，研究团队比较了pro-uPA-红细胞和单独使用pro-uPA蛋白的溶血栓活性效率。在体外实验中，在相同的条件下，pro-uPA-红细胞溶解了95%以上的新生凝块，但仅溶解了40%的止血凝块，而pro-uPA蛋白对止血凝块和新生凝块的溶栓活性没有任何差异。
这些实验数据表明，pro-uPA-红细胞具有有效的溶栓活性，并选择性溶解新生凝块。
接下来，研究团队在小鼠模型体内进一步验证了pro-uPA-红细胞的寿命及其在体内的活性。结果表明，pro-uPA-红细胞在体内稳定，在输注后60分钟内保持其溶栓活性，而单独的pro-uPA蛋白在注射5分钟后就检测不到了。重要的是，输注后24天，在pro-uPA-红细胞表面仍可检测到pro-uPA信号，这表明pro-uPA-红细胞在体内具有良好的稳定性。
这些实验数据表明，pro-uPA-红细胞具有作为体内稳定和有效的溶栓疗法的潜力。
此外，研究团队还进一步证实了pro-uPA-红细胞具有预防内源性血栓形成的效果，还具有预防和治疗肺栓塞（PE）的潜力。
综上所述，该研究开发了一种高效的红细胞工程策略，该策略允许药物分子稳定地结合到红细胞上，而这种工程化的红细胞在体内的循环半衰期与野生型红细胞相同。这种新型红细胞载药平台为广泛的心血管和代谢性疾病治疗带来了新的选择。
高晓飞研究员
高晓飞研究员于2019年创立了西湖生物医药科技（杭州）有限公司，这是国内首家红细胞治疗公司。目前该公司已完成约4亿元人民币融资。
西湖生物医药开发了红细胞工程化改造平台——REDx，通过体外工程化技术，生产人体外周血干细胞来源或成体红细胞来源的具有治疗功能的工程化红细胞，回输人体后治疗各类人类重大疾病。目前的研发管线包括肺癌、宫颈癌、脑癌等癌症，以及痛风、败血症等免疫与代谢类疾病。
论文链接：
https://www.nature.com/articles/s41422-023-00868-2
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