NC｜利用CRISPR-Cas12a进行可编程RNA检测

CRISPR/Cas系统是一种在原核生物中发现的适应性免疫系统，它能够对核酸实现精准切割来实现对基因的精准高效调控，被广泛应用于功能基因研究，疾病模型建立，分子检测，核酸检测等领域中。在原核生物中发现了几种不同的自然发生的CRISPR/Cas系统。其中，Cas12a是2类，V型RNA引导的DNA内切酶。自发现以来，它已被广泛用于基因组编辑和分子诊断应用。结构和生化研究表明，Cas12a可以催化DNA底物的切割，但没有报道Cas12a在没有逆转录等预处理步骤的情况下切割靶向RNA。V型Cas12酶家族的一个特殊特征是它们能够在靶特异性识别和切割后，对其附近的任何非特异性单链DNA (ssDNA)分子进行快速和不加区分的切割。这种独特的催化性质，被称为反式切割，已被用来设计基于CRISPR的诊断工具。

到目前为止，基于cas12的工具仅限于检测DNA底物。前人研究已经证明CRISPR-Cas12a仅当RNA位于非靶链时，可以检测DNA/RNA异源双链分子。因此可以用Cas12a检测RNA靶标，只需使用逆转录步骤创建异源双链而无需扩增。然而逆转录步骤增加了时间，成本，错误和分析的复杂性。

Cas12a同源物需要一个存在于目标DNA上短的原间隔邻近基序(PAM)以启动识别和切割。先前研究表明，Cas9等DNA切割酶也可以通过添加PAMmer序列来切割RNA, PAMmer序列是一种含有PAM的寡核苷酸，它被退火到目标ssRNA上以启动切割。然而，类似的方法尚未在Cas12等反式切割Cas酶中进行研究，主要是因为Cas9和Cas12酶之间的PAM识别机制不同。例如，与Cas9不同，Cas12a可以使用无PAM的ssDNA识别甚至触发反式切割活性。迄今为止，还没有发现单一的CRISPR-Cas系统能够天生耐受DNA和RNA底物来触发反式切割。

2023年9月5日，Nature Communications 在线发表了一篇题为“Programmable RNA detection with CRISPR-Cas12a”的研究论文。作者开发了一种用Cas12a直接检测RNA的工具，SAHARA。SAHARA简单但功能强大，可以以多路复用方式应用，并有可能扩展到其他CRISPR-Cas酶。

作者发现Cas12a可以在crRNA的PAM远端耐受RNA底物并启动反式切割活性。虽然crRNA的PAM近端区严格耐受DNA底物，但crRNA的PAM远端可以耐受具有多个Cas12a同源物的RNA和DNA底物。因此，只需在crRNA的近端区提供短的ssDNA或含有PAM的dsDNA，我们就可以在crRNA的3 '端检测RNA底物。这种特性是使用Cas12a进行RNA检测方法的基础，该方法命名为Split Activators for Highly Accessible RNA Analysis (SAHARA)。

SAHARA无需扩增即可实现对皮摩尔水平DNA和RNA的无逆转录(RTx)检测，并可检测临床相关靶标，包括丙型肝炎病毒(HCV) RNA和microRNA-155 (miR-155)。作者研究表明，与传统的CRISPR/Cas12a系统相比，SAHARA在室温下稳定工作，并且具有更高的点突变检测特异性。作者利用这种开关能力同时检测不同的DNA和RNA目标。

作者还表明，SAHARA可以与Cas13b一起工作，对不同的RNA靶点进行多路检测。综上所述，SAHARA是一种有简单高效的多功能工具，可以同时检测DNA和RNA底物。这些关键发现为Cas12a的反式切割活性对底物的要求提供了研究基础。

原文链接：

https://www.nature.com/articles/s41467-023-41006-1

转自：“植物生物技术Pbj”微信公众号

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