来源：病毒学界
近日，来自圣路易斯华盛顿医学院的吴超博士（现已全职加入深圳湾实验室）及其团队在埃博拉病毒复制细胞器的早期形成方面取得重要进展，并在BSL-4实验室成功探索病毒复制细胞器与活病毒感染的关系。研究成果以The intricacies of Ebola NP0VP35 formation of inclusion body-like structures and their disruption reducing viral infection为题发表于Journal of Molecular Biology期刊上。
埃博拉病毒是目前已知对人类生命健康危害最大的病原体，被称为“生命的黑板擦”。埃博拉病毒可在细胞内形成病毒包涵体（IBs），作为病毒复制和组装的场所（图1），同时也避免了宿主的免疫反应(图2)。关于埃博拉病毒包涵体的形成机制尚不清楚，但被认为与一种由核蛋白（N）和磷酸蛋白（P）构成的复合物有关。
图1. 单链反义RNA病毒在细胞内的复制[1]
图2. 病毒在有膜或无膜细胞器中复制[1]
在这项研究中，作者首先证明了eNP0eVP35（一种形成 N0P 复合体的丰富的早期翻译产物）是病毒质形成的最低要求。使用体外纯化的重组 N0P 复合物，发现了 EBOV 的 N0P复合物在体外自发相分离。并且这种相分离是可逆，可以用离子强度来调节。500mM NaCl 中的 eNP0VP35，液滴外观没有变化。然而，当NaCl 浓度稀释至150 mM 时，开始看到自发的相分离(图3)。
图3. eNP0VP35 通过液-液相分离形成动态液滴
为了确定相分离所需的每种蛋白质的区域，研究人员生成了一系列eVP35和eNP突变体和截短体，并评估了它们在含有150 mM NaCl的缓冲液中与其他相应的全长蛋白质结合形成液滴的能力。对于eNP，仅需要 N 端结构域 (NTD)就能进行相分离。而eVP35需要所有功能域，才能进行eNP/eVP35的相分离(图4)。
图4. eNP和eVP35截短或突变体对相分离的影响
研究还证明，eVP35（而非eNP）的多价性质对于相分离尤其重要。通过交联质谱法对液滴内相分离的eNP/eVP35蛋白进行进一步表征，揭示了两种蛋白之间的多种直接相互作用，这与稀释条件下溶液中的相互作用不同。这些观察结果支持eNP和 eVP35 之间的高度动态相互作用，其中这两种蛋白质之间发生重排以支持相分离。相分离的eNP0VP35样品显示出 eVP35 OD和本质上无序的NTD至CTD连接体内寡聚分子间交联减少的明显证据。这些结果表明 eVP35 和 eNP 在非相分离条件下优先发生寡聚化（图5）。
图5. 相分离（暖色）和非相分离（冷色）的 eNP0VP35 复合物的不同相互作用
当作者将复制复合体成分（eNP、eVP35、eVP30 和 eL）转染到HeLa 细胞中时，可观察到IB样结构的出现，而破坏 N0P 复合物的形成会减少 IB 的形成（图6）。值得注意的是，在四级实验室条件下，观察到eNP0VP35复合物的破坏与埃博拉活病毒感染的减少相对应（图7）。
图6. 对稳定表达GFP的HeLa细胞或转染的GFP标记的eVP35突变体进行免疫荧光染色，GFP-eVP35 1-150和GFP-eVP35 20-48的表达破坏了IB的形成
图7. eNP0VP35复合物破坏与HeLa细胞被埃博拉活病毒感染减少同步
本研究具有重要的意义和价值，它不仅为理解和操纵生物分子凝结体提供了新的抗病毒策略和技术，也为探索生物分子凝结体形成的生物物理学原理、机制和应用提供了基本洞察和可能性。此外，本研究揭示了早期IBs形成所需的最小组分、生物物理特性、相互作用区域和相分离机制，并将eNP0VP35复合物确定为埃博拉抗病毒药物开发的潜在靶点。本研究还证明了破坏IBs形成可以使病毒感染产生抗药性的概念，此方法可以扩展到其他病毒。这项研究提供了有关病毒生物学、相分离和蛋白质相互作用的基本见解，同时也为未来的抗病毒研究和应用开辟了新的途径。
吴超博士于2023年4月全职加入深圳湾实验室，课题组致力于：1）病毒复制细胞器的发生机制以及体外生化重构，在病毒复制以及同宿主互作中的作用，致病机理及分子诊断，以及抗病毒药物的筛选，包括但不局限于埃博拉病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、寨卡病毒等RNA病毒；2）利用前沿生物物理手段，开发对病毒颗粒进行基于形状及内容的分选技术，以此研究病毒颗粒形状对侵染及致病性的影响，为提升包括流感疫苗在内的疫苗有效率提供理论基础；3）开发病毒复制小分子抑制剂以及高通量血清学技术。
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