目前使用的光敏剂存在成本高、制备不便、生物降解性差、缺乏生物活性等缺点，限制了其临床应用。腐植酸(HAs)具有光热活性，可作为光热治疗的光敏剂。在各种官能团存在的情况下，HAs具有抗炎和抗氧化活性。HAs的溶解度取决于pH值，HAs在中性到碱性条件下溶解，在酸性条件下发生构象变化，形成卷曲致密的结构。此外，Cu2+是一种新兴的皮肤创伤治疗剂，可以被HAs螯合形成络合物。在这项研究中，华中科技大学刘国辉/米博斌、南洋理工大学赵彦利、重庆大学冯茜制备了一种近红外(NIR)/pH双响应的纳米铜纳米粒子(NP)-聚乙烯醇(PVA)水凝胶薄膜，负载了巨噬细胞募集剂SEW2871(SEW)，用于治疗细菌感染的皮肤伤口。结果表明，HAs对M2巨噬细胞极化有促进作用，且呈剂量依赖性。通过近红外诱导的局部热疗，Cu-HAs纳米粒子成功地根除了细菌感染。这种PVA@Cu-HAs NPs@SEW水凝胶膜通过促进M2巨噬细胞极化、减轻氧化应激、促进血管生成和促进胶原沉积来改善组织再生。这些发现突出了PVA@Cu-HAs NPs@SEW水凝胶膜在治疗细菌感染的皮肤伤口愈合方面的治疗潜力。该研究以题为“Waste to Wealth: Near-Infrared/pH Dual-Responsive Copper-Humic Acid Hydrogel Films for Bacteria-Infected Cutaneous Wound Healing”的论文发表在《ACS Nano》上。
该研究首先评估了HAs是否可以在体外调节巨噬细胞的极化，并探讨了其潜在的潜在机制。然后，设计了一种近红外(NIR)/pH双响应纳米铜(NPs)-载SEW2781(SEW)的聚乙烯醇(PVA)水凝胶薄膜，用于治疗细菌感染的皮肤伤口。通过近红外诱导的局部加温，SEW的持续释放，以及体内HAs和Cu2+的定时释放，PVA@Cu-HAs NPs@SEW水凝胶膜能够根除细菌感染，调节炎症反应，缓解氧化应激，恢复血管生成，促进胶原沉积，全面加速细菌感染的皮肤伤口愈合。
方案1.PVA@Cu-HAs NPs@SEW水凝胶膜促进细菌感染皮肤创面愈合的应用示意图
【有促进M2巨噬细胞极化的作用】
为了探讨HAs对M2巨噬细胞极化的调节作用，该研究用不同浓度的HAs处理RAW264.7细胞。以IL-4治疗为阳性对照。8h后用流式细胞仪分析RAW264.7细胞的M2偏振率。发现1 mg/mLHAs诱导RAW264.7细胞M2极化，M2巨噬细胞比例达77.3%。
图1. HAs对RAW264.7细胞M2巨噬细胞极化的影响
【HAs处理后RAW264.7细胞转录水平的变化】
为了确定HAs处理RAW264.7细胞后基因表达谱的变化，该研究对0.5 mg/mL HAs处理前后的RAW264.7细胞进行了转录RNA测序(RNA-Seq)分析。结果表明，HAs处理导致了与轴突发育、损伤反应、突触膜和肝素结合相关的差异表达基因。此外，反应组富集分析结果表明，HAs处理还导致了与ECM蛋白多糖、整合素细胞表面相互作用和RAF非依赖性MAPK1/3激活相关的基因表达的变化。基因集浓缩分析(GSEA)结果进一步表明HAs处理可诱导RAW264.7细胞炎症反应的改变。推测HAs可能通过核因子-kB、丝裂原活化蛋白激酶和IL-17信号通路诱导M2巨噬细胞极化。需要进一步的研究才能充分了解这些机制。
图2. HAs处理RAW264.7细胞后转录水平的变化
该研究首次采用简单的螯合自组装方法，将HAs与不同比例的CuSO4·5H2O溶液混合，合成了Cu-HAs纳米粒子。制备的Cu-HAs纳米粒子呈黑色，在水溶液中分散性良好。
图3. Cu-HAs NPs溶液的表征
【纳米铜纳米粒子的光热和抗菌性能】
通过监测Cu-HAs 在500s后808 nm激光(1.5W cm−2)照射下的水温变化来确定其光热性能。HAs和Cu-HAs纳米粒子在近红外(1.5W cm−2)照射下都表现出浓度依赖的温度变化。Cu-HAs纳米粒子的温度变化比HAs更明显，表明Cu2+的络合作用提高了其光热转换效率。Cu-HAs纳米粒子可重复用于光疗，四个加热和冷却循环后的温度波动可以忽略不计。此外，近红外照射后，铜纳米颗粒的UV可见-近红外吸收光谱变化不明显，说明铜纳米颗粒具有良好的光热稳定性。在808 nm激光照射下，Cu-HAs纳米粒子对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑制率分别达到99.42%和97.06%,表现出优异的抗菌性能。
图4. 纳米铜纳米粒子的光热性能和抗菌活性
【PH响应性的Cu2+释放与Cu-HAs纳米颗粒的血管生成特性】
纵向研究表明，随着伤口愈合过程的进行，伤口环境中的pH值逐渐增加。完整皮肤的pH值从4到6，随着深度的增加逐渐增加。在细菌感染的伤口愈合过程中，pH值逐渐升高并变得更具碱性，通常在7.5-8.9。Cu-HAs纳米粒子在中性至碱性条件下可溶于某种形式，在酸性条件下经历构象变化，形成卷曲致密的结构。随着pH值的升高(pH>7)，通常在创面愈合的中晚期，Cu2+的释放量明显增加。与对照组(PBS)相比，加入不同浓度的Cu-HAs纳米颗粒对HUVECs的迁移有不同程度的促进作用。HUEVCs迁移的良好促进可能使Cu-HAs纳米粒有效促进血管生成。
图5. Cu-HAs纳米粒子的pH响应行为和血管生成特性
【含铜纳米粒子的抗氧化作用】
通过DPPH清除实验和ABTS+清除实验评价Cu-HAs纳米粒的抗氧化能力。DPPH清除实验结果表明，Cu-HAs纳米颗粒具剂量依赖的抗氧化能力。同样，ABTS+清理结果也显示了类似的趋势。Cu-HAs纳米粒具有较强的清除自由基的能力，并能在创面愈合的早期发挥其抗氧化能力。
为了研究Cu-HAs纳米颗粒的细胞抗氧化能力，该研究用不同浓度的Cu-HAs纳米颗粒处理L929细胞。不同浓度的Cu-HAs NPs处理的细胞的ROS水平比没有处理的细胞低得多。同时，荧光强度随纳米铜含量的增加而减弱。细胞骨架染色和细胞凋亡检测进一步证实了Cu-HAs纳米颗粒对细胞氧化应激损伤的保护作用。过氧化氢过量引起的氧化应激导致细胞骨架损伤，经Cu-HAs纳米颗粒处理后，这种损伤得到改善，尤其是1 mg/mL Cu-HAs纳米颗粒组。
图6. Cu-HAs纳米颗粒的体外抗氧化能力
【PVA@Cu-HAs水凝胶膜的制备与表征】
为了更好地实现Cu-HAs NPs的输送，该研究在PVA中加入了不同浓度的Cu-HAs NPs，形成了PVA@Cu-HAs NPs水凝胶膜。Cu-HAs纳米颗粒的整合降低了PVA水凝胶膜的柔韧性，适合承受伤口上的剪切力和拉力。用Live/Dead染色检测PVA和PVA@Cu-HAs纳米粒子水凝胶膜对L929细胞的细胞相容性。结果表明，PVA和PVA@Cu-HAS纳米颗粒水凝胶膜的细胞毒性较低，且Cu-HAs NPs对L929细胞的增殖有潜在的刺激作用。接下来，研究了PVA@Cu-HAs NPs水凝胶膜对巨噬细胞极化的影响，结果表明，PVA@NPs-0.5水凝胶膜处理RAW264.7细胞后，诱导了CD206+的表达，同时抑制了CD86+的表达。综上所述，PVA@NPS-0.5水凝胶膜具有良好的稳定性、力学性能、细胞相容性和生物活性，是一种安全的药物释放系统，值得进一步研究。迁移实验结果表明，负载SEW的PVA@NPs-0.5水凝胶膜能够促进RAW264.7-细胞的迁移，表明其在体内具有促进巨噬细胞募集的潜在作用。
图7. PVA@Cu-HAs纳米水凝胶膜的表征
【PVA@Cu-HAS NPs@SEW水凝胶膜的体内创面愈合性能】
为了确定水凝胶膜是否能促进感染创面的愈合，建立了SD大鼠感染创面模型，观察了不同处理方法对创面愈合过程的影响。PVA@NPs/SEW/NIR组创面闭合率高于其他组。此外，还对创面进行了组织学检查，以确定不同治疗方法的修复效果。苏木精-伊红(HE)染色显示PVA@NPs/SEW/NIR组上皮化程度好于其他组。与其他组相比，PVA@NPs/SEW/NIR组创面炎症细胞较少，毛囊再生程度较高。
图8. PVA@Cu-HAs纳米水凝胶膜促进感染创面愈合的体内实验研究
【PVA@NPs@SEW水凝胶膜可减轻炎症反应，促进血管生成，降低体内ROS水平】
为了研究水凝胶膜是否促进体内血管生成，该研究检测了VEGF水平和CD31+血管的比例。在PVA@NPs水凝胶膜处理的创面中，尤其是PVA@NPs/SEW/NIR组，可以看到更高的VEGF水平和更多的CD31+血管，这表明血管生成增强,且PVA@NPs/SEW/NIR组具有良好的体内ROS清除能力和抗氧化能力。
图9. PVA@Cu-HAs纳米粒子水凝胶膜促进M2巨噬细胞极化，促进血管生成，改善体内ROS生成
【小结】
在这里，该研究使用金黄色葡萄球菌建立了伤口感染的大鼠模型。与对照组相比，PVA、Cu-HAs、NPs、SEW水凝胶膜和近红外照射组大鼠创面闭合率提高，创面肉芽组织形成和胶原沉积增加。基于这些结果，PVA@Cu-HAs NPs@SEW水凝胶膜是治疗皮肤感染创面的有效方法。然而，本研究仍存在一定的局限性。虽然降低ROS水平可以促进伤口愈合，但ROS也是提高抗菌效果的重要因素。需要付出更多努力来实现早期ROS储备和后期ROS减少之间的平衡，以促进感染伤口的愈合。此外，由于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)感染目前在医院和社区都是一个严重的问题，将在后续研究中确定Cu-HAs纳米粒子对MRSA的抗菌作用。
来源：BioMed科技
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