英文原题：Optical Control of Protein Functions via Genetically Encoded Photocaged Aspartic Acids
通讯作者：王杰，南方科技大学；陈鹏、樊新元，北京大学
作者：Xianrui Zhang, Haoran Huang, Yuan Liu, Zhigang Wu, Fengzhang Wang, Xinyuan Fan*, Peng R. Chen*, and Jie Wang*
近日，南方科技大学王杰课题组与北京大学陈鹏/樊新元研究团队合作在J. Am. Chem. Soc. 杂志上发表了题为“Optical control of protein functions via genetically encoded photocaged aspartic acids”的论文。在这项工作中，作者利用遗传密码子拓展技术，将生物正交的光脱笼技术扩展到了天冬氨酸（Asp）上，实现了一系列蛋白质功能的光控调节，其中包括萤火虫荧光酶（FLuc）、激酶（BRAF）、GTP酶（KRAS），并对磷酸化信号进行了原位模拟与调控。该技术进一步拓展了脱笼化学的应用边界，解锁了活细胞中蛋白质的天冬氨酸残基的原位、实时、快速的功能调控。
图1 天冬氨酸在蛋白质功能中的重要作用
天冬氨酸 (Asp) 在诸多蛋白质功能和蛋白相互作用中发挥着关键作用（图1）。在作者的前期研究工作中，曾对127个酶口袋的3,500个残基进行分析，其中天冬氨酸不仅有着较高的丰度，还具有较高的“保守性”（无论是将酶口袋的天冬氨酸突变为其他氨基酸，还是将其他氨基酸突变为天冬氨酸，蛋白的稳定性都大概率下降），这提示天冬氨酸在蛋白质的众多功能中扮演者重要且不可替代的作用。实际上，天冬氨酸不仅是酯酶、蛋白酶、细胞色素氧化酶等酶的催化中心的关键残基，同时也在激酶、GTPase等家族蛋白中高度保守的基序中出现，而且还是金属蛋白中Zn离子、Fe离子、Mg离子的重要结合残基。不仅如此，天冬氨酸还是caspase家族蛋白底物识别是关键位点，也是阴离子-Π相互作用和盐桥相互作用的主要参与残基。因此，发展针对天冬氨酸侧链的“脱笼”化学，将对研究蛋白质的功能提供有力的工具。
虽然在过去十年的研究中，光脱笼化学已经成为在活体环境下精确操控生物大分子功能的有效方法，并在赖氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、丝氨酸和谷氨酸上均已实现脱笼化学的开发，但针对天冬氨酸的脱笼化学至今仍是领域内的一大挑战。为此作者首先设计了两种光控脱笼的天冬氨酸ONBD和MeONBD，并通过计算辅助定向进化对吡咯赖氨酸氨酰tRNA合成酶（PylRS）进行了改造，识别了ONBD和MeONBD这两种非天然氨基酸，从而将ONBD和MeONBD定点插入到目的蛋白中。
随后，作者证明了定向进化所获的合成酶突变体（ONBD-RS）在E.coli 以及HEK293T细胞中均可以在GFP蛋白中进行定点引入(Me)ONBD，并在活细胞中以萤火虫荧光素酶(FLuc)、BRAF-V600E激酶致癌突变体、KRAS的系列致癌突变体为例，证实了该方法可以用于活细胞蛋白质的激活。值得注意的是，BRAF-D594和KRAS-D57均为结合镁离子的关键残基，通过螯合镁离子从而结合三磷酸腺苷（ATP）或三磷酸鸟苷（GTP），通过对这些天冬氨酸的保护和脱保护，很好的实现了对其功能的原位调控。这些实例为后续调控细胞中的ATP/GTP/CTP/UTP和ADP/GDP/CDP/UDP结合蛋白提供了通用的研究范式和普适的调控方法。
图2 天冬氨酸的化学脱笼用于调控活细胞蛋白质的功能
在利用(Me)ONBD这一工具实现GTPase的激活中，作者通过对比各种GTPase的蛋白质序列，发现在GTPase中存在一个非常保守的DTAG-motif，对GTPase的功能起到了关键作用。他们选取了KRAS蛋白作为GTPase的代表进行了后续的研究。KRAS基因是人体广泛存在的原癌基因之一，该基因突变对癌症的发生有着重要的推动作用。KRAS的致癌突变，如G12C、G12V、G12D和G13D，是多种癌症的关键驱动因素。在这样的背景下，作者在KRAS的不同致癌突变体中将MeONBD插入在D57位，此时KRAS的活性被抑制。随后，通过光照对这些蛋白同时进行激活，可以在活细胞水平上比较不同突变对信号转导的驱动力。作者发现在各组KRAS表达量相近的条件下，野生型的KRAS蛋白只能导致ERK磷酸化的微弱上调，但是KRAS致癌突变体的激活都表现出非常快的信号转导速率（5分钟）。而且，KRAS-G13D相比较其他三种突变体对其下游地位有着更强更快的激活作用，因此推测KRAS-G13D突变体可能在癌症发展中具有更高的驱动力。此外，作者还发现，在有或没有血清处理的细胞中激活 KRAS 突变体表现出不同的下游磷酸化动力学。当换成无血清培养基饥饿3小时，然后激活KRAS时，MEK的磷酸化可以在5分钟时达到最高水平，但在30分钟后几乎降至基础水平。然而，当在血清处理下激活KRAS时，MEK的磷酸化可在5分钟时达到最高水平，并持续处于高磷酸化水平。这一结果表明，KRAS单独触发的下游磷酸化可以通过负反馈机制进行调节，但当其他信号通路被激活到一定程度时（例如血清对照组），KRAS驱动的下游磷酸化可以保持在高水平。这些结果表明，全局性地关闭激酶的其他信号通路可以补偿或中和KRAS激活所产生的下游效应。这项时间分辨的研究很好地阐明了这两项新发现，表明在体内进行功能获得性研究将有助于剖析动态生物学过程。
最后作者通过将ONBD位点特异性地插入到目标蛋白上，原位生成了磷酸化的模拟结构，从而使得时间分辨的研究特定位点的磷酸化功能成为可能。Asp因其与蛋白质上的磷酸化丝氨酸/苏氨酸的结构和电相似性而被广泛用作磷酸化丝氨酸/苏氨酸的模拟突变。以前的研究发现，在MEK1激酶中双Asp突变（MEK1-S218D-S222D）可以模拟不可水解的双磷酸化，以提供持续激活的MEK1蛋白。为了验证S218和S222的磷酸化过程，作者分别将ONBD插入到MEK1蛋白的特定磷酸化位点中。通过将MEK1-218ONBD-222S和MEK1-218S-222ONBD的表达量控制在同一水平，来比较光照前后下游底物（ERK）的磷酸化状态。结果表明，对S218 位点进行光脱笼之后明显激活了MEK1下游的磷酸化事件，而对S222位点进行光脱笼后，其激酶活性可忽略不计。结合MEK1只能通过双重磷酸化激活的事实，作者认为S218的磷酸化可以进一步诱导S222的磷酸化。进而作者推断，在信号转导过程中，MEK1激酶的两个磷酸化位点可能存在着S218首先被磷酸化，然后诱导S222磷酸化的先后顺序。
总之，作者通过对ONBD和MeONBD的遗传编码和光化学脱笼，实现了在目的蛋白中原位和瞬时释放关键的Asp残基，为活细胞脱笼化学工具箱又增添一位重要的成员。同时，针对Asp、Glu的遗传编码“小分子化学脱笼”氨基酸正在开发中，将进一步为活体动物/组织水平的蛋白质原位激活提供利器。
本文的共同通讯作者为南方科技大学化学系王杰副教授、北京大学化学与分子工程学院陈鹏教授以及樊新元副研究员。北京大学2020级博士生张贤睿、南方科技大学2020级硕士生黄浩然为本文的共同第一作者，北京大学王初课题组刘源博士、王冯璋同学以及南方科技大学王杰课题组武志刚博士也为本课题做出了贡献。该工作得到了国家自然科学基金委、科技部国家重点研发计划、北京分子科学国家研究中心、深圳市科创委等项目的经费支持。
转自：“ACS美国化学会”微信公众号
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