基因货物的运送仍然是实验疗法成功转化的最大障碍之一，这在很大程度上是由于缺乏可靶向的运送载体。包膜递送方式使用病毒包膜蛋白，它决定向性并诱导膜融合。
2023年8月23日，博德研究所张锋团队在Nature Communications 在线发表题为“Cell type-specific delivery by modular envelope design”的研究论文，该研究开发了DIRECTED(Delivery to Intended REcipient Cells Through Envelope Design)，这是一个模块化平台，由单独的融合和靶向组件组成。
为了实现高模块化和可编程的细胞类型特异性，该研究开发了多种策略来招募或固定病毒包膜上的抗体，包括嵌合抗体结合蛋白和SNAP标签，可以使用抗体或其他蛋白质作为靶向分子。此外，该研究发现来自多个病毒家族的融合原与DIRECTED兼容，并且DIRECTED成分可以靶向多种递送底盘(例如，慢病毒和MMLV gag)到特定的细胞类型，包括PBMCs和全血中的原代人T细胞。
另外，2023年4月5日，博德研究所张锋及东京大学Osamu Nureki等团队合作在Nature 在线发表题为“Cryo-EM structure of the transposon-associated TnpB enzyme”的研究论文，该研究报道了耐辐射球菌（Deinococcus radiodurans）ISDra2 TnpB及其同源ωRNA和靶DNA复合物的冷冻电镜结构。在结构上ωRNA采用了一种意想不到的结构，形成了一个假结，在所有Cas12酶的引导RNA中是保守的。此外，该结构以及功能分析揭示了紧凑的TnpB如何识别ωRNA并切割与向导互补的目标DNA。TnpB与Cas12酶的结构比较表明，通过不对称二聚体形成或多种REC2插入，CRISPR-Cas12效应物获得了识别引导RNA-靶DNA异源双链体的原间隔-邻近基序-远端的能力，从而参与CRISPR-Cas适应性免疫。总的来说，该研究提供了TnpB功能的机制见解，并推进了我们对从转座子编码的TnpB蛋白到CRISPR-Cas12效应物的进化的理解（点击阅读）。
2023年6月28日，博德研究所张锋团队在Nature 在线发表题为“Fanzor is a eukaryotic programmable RNA-guided endonuclease”的研究论文，该研究报告了Fz的生化特性，表明它是一种RNA引导的DNA内切酶。该研究还表明Fz可以被重新编程用于人类基因组工程应用。该研究利用冷冻电镜分析了Spizellomyces punctatus Fz (SpuFz)在2.7Å的结构，揭示了Fz、TnpB和Cas12之间的核心区域的保守性，尽管同源RNA结构不同。总之，该研究结果表明Fz是真核生物的OMEGA系统，表明RNA引导的内切酶存在于生命的所有三个领域（点击阅读）。
2023年4月6日，博德研究所张锋团队在Science 在线发表题为“Structure of the R2 non-LTR retrotransposon initiating target-primed reverse transcription”的研究论文，该研究报道了Bombyx mori R2 non-LTR逆转录转座子在其核糖体DNA靶点处启动TPRT的冷冻电子显微镜结构。目标DNA序列在插入位点被解开，并被上游基序识别。逆转录酶(RT)结构域的延伸识别逆转录转座子RNA，并引导3 '端进入RT活性位点以模板逆转录。该研究使用Cas9在体外将R2重定向到非原生序列，这表明未来可以作为一种基于可重编程RNA的基因插入工具（点击阅读）。
2023年3月29日，博德研究所张锋团队在Nature 在线发表题为“Programmable protein delivery with a bacterial contractile injection system”的研究论文，该研究发现Photorhabdus毒力盒(PVC)——来自昆虫病原细菌Photorhabdus asymbiotica的eCIS——的目标选择是由PVC尾纤维的远端结合元件对目标受体的特异性识别介导的。在尾巴纤维的结构引导工程中，该研究表明PVC可以被重新编程，以靶向这些系统不天然靶向的生物(包括人类细胞和小鼠)，效率接近100%。最后，该研究发现PVC可以装载不同的蛋白质载荷，包括Cas9、碱基编辑器和毒素，并可以将它们功能性地输送到人类细胞中。总之，该研究结果表明PVC是一种可编程的蛋白质传递装置，可能应用于基因治疗、癌症治疗和生物控制（点击阅读）。
2023年1月5日，博德研究所/哈佛医学院/麻省理工学院张锋团队在Cell在线发表题为“A transcription factor atlas of directed differentiation”的研究论文，为了全面了解TF及其控制的程序，该研究创建了一个包含所有注释的人类TF剪接异构体的条形码库(> 3500)，并将其应用于构建TF图谱，以单细胞分辨率绘制过表达每个TF的人类胚胎干细胞(hESCs)的表达谱。该研究将TF诱导的表达谱映射到参考细胞类型，并验证候选TF用于生成不同的细胞类型，涵盖所有三个胚层和滋养层。具有库子集的靶向筛选使研究人员能够创建定制的细胞疾病模型，并整合mRNA表达和染色质可及性数据，以识别下游调控因子。最后，该研究通过开发和验证一种预测TF组合的策略来描述组合TF过表达的影响，该策略产生匹配参考细胞类型的目标表达谱，以加速细胞工程工作（点击阅读）
在基因治疗领域，一个关键的未满足的需求是能够将生物货物，如DNA, RNA，蛋白质或核糖核蛋白(RNPs)稳定地递送到广泛的靶细胞类型。迄今为止，腺相关病毒(AAV)载体已经实现了一定的趋向性，例如，对于肌细胞和大脑，但许多组织不能靶向，并且在肝脏中的生物积累仍然存在问题。使用包膜病毒元素的其他递送方法，如慢病毒载体、纳米叶片、eVLPs、工程化外泌体或内源性逆转录病毒蛋白，通过假分型为工程趋向性提供了平台，在假分型过程中，病毒融合蛋白(或融合原)呈现在载体颗粒的表面。融合原有两个主要作用：首先，它允许病毒膜与宿主细胞膜融合，从而将货物释放到靶细胞的细胞质中；其次，它通常通过与特定受体相互作用来决定颗粒的趋向性。
最常用的假型包膜蛋白是水疱性口炎病毒(VSV-G)的G蛋白。VSV-G由于与低密度脂蛋白受体(LDL-R)和其他可能广泛存在于不同细胞类型的LDL-R家族成员相互作用而具有广泛的宿主细胞趋向性。先前的研究成功地将抗主要组织相容性复合体I (MHCI)单链可变片段(scFv)整合到VSV-G的N端。用这种工程VSV-G进行假分型的慢病毒导致颗粒优先转导人类细胞而不是小鼠细胞，但这种变体降低了滴度。此外，最近的研究建立了一种失去LDL-R亲和力的VSV-G变体，当它与MHC肽复合物共表达时，可用于抗原特异性T细胞的特异性鉴定。
许多其他病毒利用融合原来实现特异性趋向性。除了VSV-G，其他几种病毒包膜蛋白已被探索其靶向特定细胞类型的能力，如针对CD4+ T细胞的HIV-1 env，针对人T、B和CD34+细胞的狒狒内源性逆转录病毒包膜糖蛋白，或针对神经细胞的狂犬病毒糖蛋白。此外，其中一些替代的fusogens也已经被改造过了。例如，蛋白A的抗体结合域已被整合到sindbis病毒包膜中，从而使抗体介导的重靶向成为可能。
DIRECTED能够在复杂环境中实现特定靶标（图源自Nature Communications ）
虽然很有前途，但这些嵌合蛋白需要单独设计以获得最佳性能。副粘病毒科的病毒，如麻疹病毒或尼帕病毒，自然地将细胞进入和细胞靶向分离为两种蛋白：融合蛋白(F)负责膜融合，第二种蛋白(麻疹病毒H或尼帕病毒G)负责受体结合。与VSV-G的工程类似，尼帕病毒的G蛋白中加入了一个靶向分子，从而能够靶向特定类型的细胞。然而，这种策略有几个缺点。在假型中使用F蛋白通常会导致生产过程中的低滴度，并且必须共同设计H(或G)蛋白以防止与F的相互作用中断。总之，这些研究强调了分离细胞进入和细胞靶向功能的潜力。
该研究描述了DIRECTED(Delivery to Intended REcipient Cells Through Envelope Design)，这是一个模块化的平台，用于实现可编程的细胞靶向，分离融合原的融合和靶向功能，可以与各种“货物”一起使用。DIRECTED包括天然和工程细胞融合组件以及多种细胞靶向策略。该研究表明，这些成分可以与慢病毒颗粒一起使用，慢病毒颗粒提供传递整合遗传信息的能力，eVLPs可以传递Cas9-sgRNA RNPs, CreVLPs可以传递Cre重组酶蛋白。DIRECTED的模块化特性使其能够在不同环境下精确定位细胞，并大大扩展了可靶向细胞类型的范围。
参考消息：
https://www.nature.com/articles/s41467-023-40788-8
转自：“iNature”微信公众号
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