短波红外发光探针用于体内示踪肿瘤疫苗及其诱导的免疫应答！
在体内非侵入性地跟踪和成像免疫细胞将为深入了解疫苗接种诱导的免疫反应提供帮助。在这里，斯坦福大学化学系戴宏杰教授团队报道了一种由聚合物包裹的NaErF4/NaYF4核壳下转换纳米粒子组成的癌症疫苗，该纳米粒子在近红外光谱窗口IIb(波长为1,500-1,700 nm)处发光，并带有表面结合的抗原(卵清蛋白)和静电络合的佐剂(B类胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤)。对荷瘤小鼠皮下注射疫苗的全身宽视野成像显示，纳米颗粒通过淋巴管迅速迁移到淋巴结，两剂疫苗导致完全根除先前存在的肿瘤并预防性抑制肿瘤生长。肿瘤微环境中抗原特异性CD8+T淋巴细胞的丰度与疫苗效力相关，正如通过静脉注射的两种近红外发射探针(CD8+T细胞靶向NaYbF4/NaYF4纳米颗粒和H-2kb/Ovalbign257-264四聚体/PBS/CDS量子点)在不同波长激发下的连续波成像和寿命成像所显示的那样，以及通过结构照明的光片显微镜对这三种纳米颗粒进行体积可视化。基于纳米颗粒的疫苗和发射红外线的成像探针可能会促进免疫疗法的设计和优化。该研究以题为“Shortwave-infrared-light-emitting probes for the in vivo tracking of cancer vaccines and the elicited immune responses”的论文发表在《Nature Biomedical Engineering》上。
【疫苗载体用pErNP的合成及1500-1700 nm波段的NIR-II/SWIR成像】
此前，该研究开发了一种立方α相下转换纳米粒子，由2%Er，2%Ce，10%Zn掺杂的NaYbF4核/NaYF4壳层(ErNP)和PbS/CdS核/壳QDs组成，发射波长在1,500-1,700 nm之间，具有毫米组织穿透深度，高信号/背景比和接近零的自荧光。ErNP的发光寿命(>4ms)比QDs(~46µS)长得多，可用于连续波(CW)和寿命模式下的双路成像，从而可以区分在相同NIR-IIb范围内发射的两个探针。
在这里，该研究是通过合成由六方β相NaErF4核(没有其他稀土掺杂，因此被称为‘纯ErNP’或pErNP)和NaYF4壳层组成的pErNP来增加成像的多重性。在808 nm或975 nm激发下，pErNP(以纯NaErF4纳米晶核为核心)表现出对Er离子的大量光吸附。得到的下转换发光在1,500-1,700 nm NIR-IIb范围内，并具有~2.7ms的长寿命发光寿命。相比之下，我们先前报道的ErNPs在NIR-IIb范围(~20.6 nm)内发射，在~900-980 nm有不同的吸收峰，发射寿命~7.1ms。PbS/CdS量子点的尺寸为~7.7 nm和宽吸收。虽然所有三种探针都在1500-1,700 nm的相同NIR-IIb范围内发射，但该研究分别通过使用脉冲808 nm激光激发后pErNPs的寿命成像、脉冲940 nm激光激发后ErNPs的寿命成像和860 nm连续QD成像，将它们区分开来进行多重成像。这种方法使三个NIR-IIb探头中的一个能够进行多路成像，而不会有来自其他两个探头的任何串扰信号。在相同的NIR-IIb 1,500-1,700 nm范围内发射的三种不同探头在没有任何串扰信号的情况下进行多路复用成像是非常重要的，因为它使所有三种探头在活体中的成像目标能够实现卓越的穿透深度和信号背景比。
图1|用于疫苗载体和多重NIR/SWIR成像的三个纳米颗粒探针在1500–1700 nm 范围内发光/发射
【pErNP-OVA-CpG B复合物作为可通过NIR-II/SWIR成像追踪的疫苗】
该研究选择pErNP-P3作为疫苗载体，因为通过DLS测量其流体动力学尺寸约为50 nm，在适合淋巴结归巢/贩运以触发适应性免疫反应的范围内。使用1-(3-二甲基氨基丙基)3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)化学将鸡蛋中的整个OVA蛋白(~45 kD)缀合到pErNP-P3上的NH2基团，然后简单地将pErNP-OVA与CpGB混合以形成pErNP-OVA-CpG B纳米复合物通过静电相互作用。
将pErNP-OVA-CpGB纳米复合物皮下注射到携带OVA表达E.G7肿瘤的C57BL/6小鼠尾部基部。pErNP不仅用作抗原/TLR9佐剂递送载体，还用作NIR-II/SWIR成像剂，用于可视化疫苗运输途径。用pErNP-OVA-CpG B接种小鼠(n = 3)一天后，收集iLN，并使用荧光激活细胞分选分离DC (CD11c+)、B细胞 (CD19+)、T细胞 (CD3+)和巨噬细胞（F4/80+）。结果发现DC、巨噬细胞和B细胞的每细胞pEr含量分别比T细胞高13.6倍、101倍和2.1倍。这表明淋巴结中的 APC能够有效吸收pErNP-OVA-CpGB纳米疫苗来启动T细胞并启动免疫反应。
图2|用于体内可追踪纳米疫苗的NIR-II/SWIR发射pE纳米颗粒
【pErNP-OVA-CpGB纳米疫苗的治疗和预防功效】
研究了皮下注射pErNP-OVA-CpG B纳米疫苗对E.G7荷瘤小鼠的治疗效果，以及pErNP-OVA (n = 8)、单独OVA (n = 8)、OVA仅与CpG B (n = 5)和PBS (n = 12)混合。结果表明用pErNP-OVA-CpG B治疗的小鼠表现出最慢的肿瘤生长，肿瘤体积在第一次给药后大约第5天开始明显缩小。加强剂量后，肿瘤继续缩小并最终消失。值得注意的是，所有17只接受 pErNP-OVA-CpGB 治疗的小鼠均以 100% 的疗效存活，在大约 30 天内没有监测到任何肿瘤再生。
为了评估pErNP-OVA-CpG B纳米复合物作为癌症疫苗的预防潜力，该研究在第二剂疫苗接种后1周将E.G7-OVA细胞皮下注射到接种疫苗的健康小鼠中，并将其与健康小鼠进行比较用两剂PBS对照治疗的小鼠(n = 3)。结果表明，pErNP-OVA-CpG B纳米复合物确实能诱导强大的保护性抗肿瘤免疫，使其成为一种有效的预防性疫苗。
图3|纳米疫苗根除小鼠已有肿瘤的治疗效果
【CD8和肽-MHC-I四聚体靶标的体内动态NIR-II分子成像】
根除小鼠体内已有肿瘤的约100%治疗效果表明pErNP-OVA-CpG B纳米复合物引发了强烈的适应性免疫反应。由于抗原特异性CD8+ CTLs负责攻击和杀死肿瘤中表达抗原的癌细胞，因此该研究探索了空间绘图/成像和时间跟踪抗原特异性CTLs，以评估体内免疫反应。成像结果表明，在pErNP-OVA-CpG B疫苗接种后，OVA抗原特异性CD8+ CTLs在肿瘤中积聚，这与CTLs有效杀死癌细胞和肿瘤缩小密切相关。与此形成鲜明对比的是，未接种疫苗的PBS处理动物组在肿瘤中的CD8+和OVA四聚体通道中均显示出可忽略不计的信号，表明肿瘤中没有OVA特异性CTLs，并且与肿瘤生长未减弱相关。
图4|宽场模式下抗原特异性CD8+ T细胞的体内双重NIR-IIb分子成像
【肿瘤中抗原特异性CD8+ CTL的体内单光子3D体积NIR-II LSM-SIM成像】
为了在肿瘤微环境中对抗原特异性CD8+ CTL进行高分辨率成像，该研究在第5天进行了三重3D体积LSM-SIM成像。结果表明NIR-IIb LSM-SIM能够在体内完整肿瘤内进行单细胞水平成像，类似于之前的CD4和OX40成像结果。
该研究使用NIR-IIb成像技术，通过完整组织以细胞分辨率对抗原特异性CD8+ CTLs进行非侵入性体内成像。为了验证体内成像结果，使用荧光团缀合的抗小鼠CD3和CD8抗体、RBD-四聚体和OVA-四聚体对从肿瘤中提取的细胞进行离体流式细胞术分析。结果进一步证实了NIR-II/SWIR分子成像是评估体内动物模型免疫反应的一种有前途的方法。
图5|肿瘤微环境中抗原特异性CD8+ CTLs的体内3D体积NIR-II LSM-SIM成像
【小结】
该研究开发了一种可以使用NIR-II/SWIR成像模式进行跟踪的纳米疫苗，用于临床前研究。实验表明，纳米疫苗通过淋巴管有效运输至小鼠的肿瘤引流淋巴结，还观察到向二级淋巴结的迁移。观察到疫苗载体pErNP的高肿瘤发光，对小鼠表现出良好的免疫治疗效果。在荷瘤小鼠中，纳米疫苗表现出优异的肿瘤根除和治疗功效，并阻止健康小鼠的肿瘤生长。此外，该研究通过宽视野和光片显微镜采用NIR-II成像来可视化体内肿瘤内抗原特异性CD8+ CTLs。该研究还监测了CD8+ CTL向肿瘤的募集情况，并纵向绘制了它们在肿瘤微环境中的分布，这对于了解癌症的免疫反应和开发新的免疫疗法非常重要。总体而言，NIR-II/SWIR发光/荧光纳米颗粒的成像和跟踪能力，允许毫米级的穿透深度、高分子特异性和非侵入性纵向监测，使它们成为涉及基础研究的一类有前景的疫苗递送载体。细胞水平和体内的免疫系统，以及设计更好的疫苗。
原文链接：
https://www.nature.com/articles/s41551-023-01083-5
来源：BioMed科技
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