坚固稳定的水下胶在工业和生物医学领域以及日常生活中都有重要的应用。然而,为干燥应用开发的合成粘合剂往往在高湿度条件下表现较差,因为它们往往与水而不是材料表面相互作用。即使一些粘接剂系统能够穿透固体表面的水合层,在长期使用过程中,大部分固化的胶水也会因水的水合和分解而逐渐崩解。相比之下,自然界中强大的水下黏附无处不在,从微观细胞的黏附到固定在外部宿主上的海洋生物的宏观黏附。在这些生物的启发下,通过儿茶酚群、聚电解质组装和超分子结构的迷人混合,精心设计了一系列出色的水下黏附系统。大多数系统都有以下缺点:成本高、原子经济性低、操作繁琐、儿茶酚基团氧化以及导致粘连降低的肿胀。更重要的是,很少有基于蛋白质的粘合剂在水中具有与天然生物粘合剂相比的粘附强度和稳定性。
在这里,陕西师范大学杨鹏教授证明了未折叠的普通蛋白通过在水中的淀粉样聚集表现出对表面的高亲和力和强大的内部凝聚力。以牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)为模型蛋白,通过三氟乙醇(trifluoroethanol, TFE)和尿素等稳定剂裂解二硫键并维持其未折叠状态,得到稳定的未折叠蛋白。稳定剂向水中的扩散暴露未折叠蛋白质的疏水残基并开始未折叠蛋白质聚集成固体块。因此,可以从数十种常见的蛋白质中制备出一种坚固而稳定的水下胶。这种策略破译了常见蛋白质中的通用密码,从而从丰富的生物量中构建出坚固的水下胶。相关工作以“Synthesis of robust underwater glues from common proteins via unfolding-aggregating strategy”发表在《Nature Communications》。
图1. 基于MD模拟的胰岛素展开聚集过程及其黏附行为
基于展开聚合的水下胶粘剂原理
黏附相关蛋白通常是非结构化的,从而提供更灵活的分子链,这些分子链可聚集成具有黏附能力的凝固块。因此,推测将普通蛋白质转化为水下胶的关键步骤是蛋白质去折叠。通常,蛋白质的生理结构是通过分子内的二硫键和一些非共价相互作用(包括静电键、疏水键和氢键相互作用)来稳定的。因此,为了获得未折叠蛋白,需要分解二硫键,然后使用比水更有利于包裹在蛋白链周围的稳定剂,如三氟乙醇(TFE)或尿素,来屏蔽蛋白链之间的非共价相互作用,从而稳定未折叠蛋白,防止其聚集。在这里,小蛋白胰岛素(1.4 kDa)被用作模型蛋白,TFE被用作典型的稳定剂进行理论分析。通过裂解所有二硫键并将蛋白质溶解在TFE水溶液(体积为80%)中进行胰岛素的分子动力学(MD)模拟。快照(图1a)和观察到的旋转半径(Rg)和溶剂可及表面积(SASA)的增加表明,胰岛素的每条链逐渐延长和分离。
图2. 未折叠胰岛素与二氧化硅表面的相互作用(MD模拟)
基板表面稳定水合层的存在会导致大多数粘合剂的强烈排斥。相反,未折叠蛋白在释放稳定剂(TFE)后,可以清除基质表面的水合层。MD模拟中二氧化硅表面水合层的分布(图2a)清楚地表明,在胰岛素链锚定在二氧化硅上之前,二氧化硅表面几乎完全被水分子覆盖。当胰岛素接触表面0.6 ns后,表面上一些不连续的实质性部分的水分子被耗尽。这表明,这些蛋白质可能通过未折叠蛋白链的某些氨基酸残基启动了二氧化硅上水合层的断裂。
图3. 牛血清白蛋白的展开和固化
然后,研究者选择了一种最便宜的蛋白质,BSA,作为模型蛋白,以探索其微观结构和性能。如图3a所示,在稳定剂扩散到水中后,由TFE预稳定的未折叠的BSA链失稳,转化为胶水,注入水中后搅拌后可以紧紧粘附在玻璃棒和烧杯底部。在去折叠过程中,BSA中的大多数二硫键被TCEP还原,这是由二硫键拉曼光谱中480~570 cm−1之间急剧下降的峰确定的。这进一步得到了N-(1-芘基)马来酰亚胺(NPM)荧光测定的增加的支持,其中NPM与还原性二硫化物的游离巯基结合显著增强了380 nm时的荧光强度。蛋白质去折叠也导致天然蛋白质的分子内堆积密度降低,这是通过同步辐射小角度X射线散射(SAXS)确定的(图3b)。
图4. 未折叠蛋白基水下胶的性能
未折叠BSA作为水下胶的粘接性能
将10 μL的蛋白胶夹在两片重叠面积为1 cm2的玻片之间,置于水中24 h,在装满水的容器中直接测量生物胶的水下黏附强度(图4a)。通过系统地调节制备条件,包括体系的pH;TFE、BSA、TCEP浓度;和反应时间,胶水与玻璃的粘接强度优化为约3 MPa在水中。未展开的BSA胶在100 s内凝固后产生相当大的瞬间黏附强度(~100 kPa),约10 h后达到最大值。值得注意的是,水下黏附能力与蛋白质各肽链的平均分子量密切相关(图4b)。分子量越大,黏附能力越强。这可能是由于固化胶的粘结力随着蛋白质分子量的增加而增强。但当分子量大于70 kDa时,粘附强度进一步降低,这是由于高分子量蛋白链的内聚力增加削弱了胶水的渗透能力(通过基材上的水合层),导致胶水与基材的接触不良。除了蛋白质的分子量外,蛋白质的去折叠程度对粘附强度也有显著影响。如图4c所示,展开度越大,机械强度和粘接强度越强。当蛋白质更未折叠时,有可能暴露更多的疏水性基团,并为界面粘附提供更好的分子链灵活性。另一方面,高度未折叠的蛋白质允许单个蛋白链参与几个成核事件,从而形成一个确保粘合性的网络结构,正如所形成的胶水的断裂强度所示。这表明,显著的去折叠程度对于蛋白质的水下黏附是至关重要的。
图5. 未折叠BSA胶的应用
由于其可靠的粘附行为,该胶水在实际应用中有很好的前景。应用方法分为三种:带式、填充式和粘接式(图5a)。在胶带式应用中,未折叠的BSA胶可以实时修复水容器或管道上的缺陷。在这里,研究者把它涂在橡胶板上,然后用一个5毫米的孔修补泄漏的橡胶管。大约1分钟后,修补过的橡胶管在100 kPa的水压下(大约相当于高压锅的工作压力)工作良好(图5b)。同样的,未展开的BSA胶可以用于处理一些紧急情况,如修补破洞(直径2 mm)的充气艇,恢复正常划船(图5c)。
图6. 未折叠的BSA胶的凝固过程及固化胶的内部结构和表面化学特性
未折叠蛋白胶的固化及粘附机理
该蛋白胶具有较高的粘附强度和在水中(以及在其他环境中)的稳定性,这可以合理地归因于强大的体黏聚力和界面粘附力。首先,较强的体聚力与凝固诱导的未折叠蛋白胶微观形态演变密切相关。首先通过有限元方法模拟了未折叠蛋白胶在两片圆形玻璃板之间的凝固过程(图6a),然后通过发光显微镜进行了实验验证。根据之前的MD模拟结果,水分子逐渐与未折叠蛋白链周围的TFE交换以去除稳定剂。因此,水从外面扩散到胶水中,伴随着未折叠蛋白链的聚集。因此,研究者构建了基于Fick第二定律的二分法模型,对凝固过程进行了理论分析,即只要胶水中水分子浓度大于38.9 mol/L(体积的70%),即认为胶水立即凝固(如图3e所示)。随着水分子向胶内扩散,最先与水接触的外胶会凝固成环状(图6b)。凝固模型的模拟结果与ThT染色荧光照片观察到的结果相似(图6c)。FE和荧光图像得到的胶凝环宽度的发展趋势高度吻合(图6d),表明凝固过程是由水分子的扩散驱动的,蛋白质周围的TFE分子逐渐被排出。
小结:综上所述,研究者通过提供一种通用的展开聚集策略,将常见的商业蛋白转化为水下胶,克服了只有某些特定蛋白表现出水下黏附的限制。不同于其他模仿自然的水下胶水,需要特定的官能团、聚合物网络结构或材料的几何形状,该胶水是由相当常见的商业蛋白质通过溶剂介导的生物聚合物链的稳定-聚集而制成的。该策略首先将数十种常见的蛋白质及其混合物通过溶剂进行折叠和稳定以抑制聚集,然后通过溶剂稳定剂的逐渐扩散,未折叠的蛋白质在水中发生可控的淀粉样聚集。在此过程中,未折叠蛋白链暴露的柔性疏水区域可以干燥湿表面,然后动态调整亲水和疏水残基,以更好地与固体表面相互作用,从而提供强大的界面附着力。此外,固化的胶水呈现出海岛结构,其中淀粉样纳米晶体提供了强大和实质性的交联点,以确保坚韧的内部凝聚力。强大的界面粘附力和黏聚力使这种胶水在极端条件下(至少2年的水下浸泡)具有高强度和优异的粘附稳定性。可作为带式、填充式、粘接式三种类型的胶水,满足不同的需求。这一策略证实了控制生物聚合物链的构象变化对于水下黏附是相当重要的,而不是仅仅引入一些特定的基团或结构。这可能为构象定向水下黏附开辟了一个新的领域。
原文链接:
https://www.nature.com/articles/s41467-023-40856-z
来源:BioMed科技
转自:“高分子科学前沿”微信公众号
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