癌旁vs癌的成对组织标本做qPCR，该如何分析qPCR数据？

我们曾经介绍过in vitro study中干预组（加药组）vs 对照组的qPCR的实验重复和数据分析，详见 原理易懂，结果难做——QPCR结果你会分析么？。即加药实验重复三次，进行pcr实验的每次设3个副孔，进行数据分析以探究加药对细胞的影响。对于同一种药物作用于同一种细胞相同的时间，理论上三次独立重复试验中药物所引起A基因mRNA水平的变化是确定的。

然而在肿瘤标本和癌旁标本的pcr实验中，因为不同个体之间的A基因mRNA水平是不一样的，所以不同个体之间不能算是实验重复，。那么应该如何进行统计作图呢？

现在有20对病人某肿瘤组织标本，每对组织有癌（T）和癌旁（N）两个组织，我们想看基因A的mRNA水平在癌和癌旁中是否有差异？

实验设计及结果

对20对标本（40个组织）分别采用提取组织mRNA的方式，protocol可以在科研狗网站http://www.keyangou.com 中找到，然后逆转录成cDNA。

进行qPCR之后我们会得到如下结果（只展示了第一对和第二对标本组织，T1代表第一对的癌组织，N1代表第一对的癌旁组织）：

然后我们做完20对组织的qPCR之后，整理数据得到如下结果：

按照上一次案例1里面的统计方法去画图，

如果我们按照上一次案例1里面的统计方法去做，先求出N（癌旁）2^-△Ct的平均值n1，然后用T(癌) 2^-△Ct分别除以n1，再用每个N（癌旁）2^-△Ct处理n1，就得到了最终可以统计的结果T(癌) 2^-△△Ct，和N（癌旁）2^-△△Ct，具体计算过程就不罗列了，整理结果如下：

如果接着作图，会出现如下结果：

你是不是吓一跳，癌和癌旁是不是没差异了？

但是仔细一看，从数据角度看来所有的癌里面A的表达水平都比癌旁低啊，为什么做到这个图上面，看上去这么不可能呢。

那么问题究竟出在哪里呢？

首先上一节中我们是三次重复试验，对于同一种药物作用于同一种细胞相同的时间，理论上三次独立重复试验中药物引起p53 mRNA水平的变化是确定的，而在本案例中，不同病人之间的标本不能算作是实验重复，不同个体之间的A基因mRNA水平也是不一样的。因此，不能采用案例1中的计算方式。

下面首先介绍下我们常用的模式：

我们用每组的T(癌) 2^-△Ct除以N（癌旁）2^-△Ct，得到T(癌) 2^-△△Ct，这样一来，N（癌旁）2^-△△Ct都为1，然后整理结果得到如下：

然后作图得到如下：

这个是不是比第一次柱形图好看？

但是这种做法其实是有问题的，虽然看上去差异比较大（通过统计计算差异也比较大），但是N（癌旁）已经没有误差，这是不科学的。

所以在本文中，我们认为应该以T(癌) 2^-△C和N（癌旁）2^-△Ct做成散点图，如下所示（注意不是△△），如果你有更好的想法可以告诉我们一起交流学习。

把Y轴调整下如下：

可以看出，在癌旁组散点图位置均上移。我们通过SPSS软件统计分析两组之间的差异：

采用配对T检验（T检验的前提是样本服从正态分布，可以提前检测下，一般测定某一个蛋白或者mRNA的水平，可以看作是正态分布）。

p=0.007, 具有显著性差异。

转自：“医学科研小坑”微信公众号

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