原文题目：In vivo hematopoietic stem cell modification by mRNA delivery
通讯作者：HAMIDEH PARHIZ
隶属单位：美国宾夕法尼亚州费城宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院传染病系
DOI：10.1126/science.ade6967
骨髓干细胞是体内所有造血（血液）细胞的来源。对于血液疾病患者，用健康供体骨髓进行骨髓移植可能是一种非常成功的治疗方法，并且可以治愈某些疾病。布雷达等.设计了一种策略，直接在体内重新编程骨髓干细胞，而无需供体细胞或使用潜在的有毒预处理方案，如化疗或放疗（见法拉利和纳尔迪尼的观点）。信使RNA通过静脉注射脂质纳米颗粒递送到骨髓干细胞，促进基因编辑和骨髓移植。在不需要传统移植方法的情况下在患者体内设计骨髓细胞的能力可以为许多遗传疾病带来希望。
图 1：WBM或造血祖细胞的体外靶向与包封荧光素酶（CD117 / LNP-Luc）或Cre重组酶（CD117 / LNP-Cre）mRNA的LNP一起孵育的细胞
造血干细胞（HSC）存在于骨髓（BM）中，它们在整个生命中分裂，通过其自我更新能力产生血液和免疫系统的所有细胞。它们的多能性能够形成骨髓（红细胞、巨核细胞和髓细胞免疫）和淋巴细胞祖细胞。HSC移植（HSCT）用健康的HSC代替患病的HSC，可以治愈非恶性造血疾病，如血红蛋白病和免疫缺陷。非恶性造血性疾病可通过同种异体 HSCT（其中 HSC 来源来自兄弟姐妹、父母或非亲缘供者）治愈，但只有一小部分患者具有合适的免疫学匹配，以尽量减少移植物抗宿主病 （GVHD） 的潜在致命并发症。基因治疗可以通过使用自体HSC（从实际患者获得HSC）来消除GVHD的风险并纠正非恶性造血障碍，并通过基因添加或编辑来替代遗传缺陷。
图 2.CD117 / LNP-Cre离体治疗导致移植后几乎完全的tdTomato基因编辑
目前的造血基因治疗需要从患者身上分离HSC，并离体慢病毒转导以进行基因添加或使用纯化试剂进行电穿孔以进行基因组编辑。“调理”方案，如化疗或放疗，用于消除患者自身的造血干细胞。这在BM生态位中留出了空间，以允许植入输注的同种异体供体或转基因自体HSC。预处理程序具有严重的急性和慢性全身毒性，包括不孕症和由于累积的DNA损伤引起的继发性恶性肿瘤。此外，一些非恶性造血障碍是由DNA修复途径突变引起的，例如放射敏感性严重联合免疫缺陷（SCID）或范可尼贫血。这些患者不能耐受现有的预处理，因为烷化化疗或放疗毒性过度，以及长期恶性肿瘤发生率增加。因此，研究试图通过开发一种灵活的方法来解决两个主要挑战，该方法可以修改体内HSC并单独建立一种无遗传毒性的预处理方法。
图 3.CD117/LNP-Cre制剂在体内注射后导致LT-HSCs中>50%的tdTomato标记。
在这里，研究描述了一种HSC靶向脂质纳米颗粒（LNP），它包封mRNA并使用与LNP偶联的CD117抗体（CD117 / LNP-mRNA）。HSC依赖于基质衍生因子，包括干细胞因子（SCF），其与受体c-Kit（CD117）结合。CD117在短期和长期HSC和一些造血祖细胞上均有表达。CD117在SCF结合后内化，研究假设这可能促进或增强LNP内化。核苷修饰和纯化的mRNA是非免疫原性的、稳定的和可扩展的，可用于表达几乎任何感兴趣的蛋白质。LNP是迄今为止最有希望的递送系统，以实现mRNA的治疗潜力。这些LNP含有可电离的脂质（在pH<6.4带正电荷），有助于包装mRNA和内体逃逸。这种LNP于2018年首次被批准用于小干扰RNA，但由于莫德纳和辉瑞COVID-19疫苗的LNP-mRNA平台，这种LNP在2020年被广泛使用。这些美国食品和药物管理局批准的疫苗中的LNP-mRNA驱动抗原表达，但确实ES不主动靶向特定细胞或器官。通过用靶向部分装饰LNP的表面，研究已经证明了对特定细胞类型（例如内皮细胞和T细胞）的有效靶向，在小鼠中单次静脉注射具有治疗效果，如研究之前的报告所述。
图 4.用人CD6靶向LNP对E117V镰状细胞突变进行碱基编辑
在这项工作中，研究使用编码环AMP反应元件（Cre）重组酶的核苷修饰mRNA，CRISPR-Cas9腺嘌呤碱基编辑器融合基因或CD117 / LNP-mRNA中的仅促凋亡BH3基因PUMA（p53上调细胞凋亡调节剂）分别通过非遗传毒性条件改变HSC，纠正疾病突变或消耗HSC。先前的研究表明，通过免疫毒素或放射免疫疗法进行的HSC耗竭可以作为HSCT，但它们只能作为HSC耗竭的平台，而不是交付其他货物。研究的原理验证数据揭示了一种在体内靶向HSC的创新和灵活的方法，这可能通过提供能够进行基因组工程的基于mRNA的靶向疗法，为修改HSC行为和纠正基因突变铺平道路。
装载了不同mRNA货物的LNP可以通过单次全身注射原位访问小鼠BM生态位中的HSC。通过靶向部分（抗CD117抗体）的偶联，BM生态位中LT-HSC的递送效果大大提高。在这项工作中，研究表明，装载有Cre mRNA货物的LNP可以在LT-HSCs离体和体内诱导持久的基因组编辑，达到或高于据报道治愈非恶性造血疾病所需的水平，这些疾病影响具有同种异体或自体基因修饰细胞的红系。这种方法被翻译成原代人细胞，为此研究能够在镰状细胞病患者的造血细胞中实现高治疗碱基编辑率。
图 5.使用CD117 / LNP-PUMA进行HSC耗竭和移植预处理。
此外，研究证明了一种靶向LNP-mRNA的基因药物可以利用研究对HSC生物学（Mcl-1途径依赖性）的理解来影响体内细胞状态的变化，并具有生理作用。研究使用该系统在体内消耗HSC，而没有通常导致肺，肝脏和生殖毒性。尽管这种预处理方法需要额外的改进以降低毒性，例如修改以限制LNP嗜性和/或进一步限制意外细胞中的基因表达，但这有能力取代当前的骨髓消融方法。这些发现可能会以两种方式改变基因治疗。首先，通过简单的静脉输注靶向基因药物来治愈单基因疾病，包括非恶性造血性疾病（血红蛋白病、先天性贫血或血小板减少症以及免疫缺陷）和非造血性疾病（囊性纤维化、代谢紊乱和肌病）。其次，以最小的风险影响体内细胞类型特异性状态的变化，可以实现以前不可能的生理学操作。这种输送系统可能有助于转化数十年协同遗传和生物医学研究的承诺，以治疗广泛的人类疾病。
DOI：10.1126/science.ade6967
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