研究背景：
长期缺氧会引发缺氧性器官损伤，同时也直接扰乱了血管网络，这是主要的氧气输送系统。实际上，持续的缺氧与许多血管疾病相关，优先影响动脉，如肺动脉高压（PH）。在临床上，慢性缺氧是肺动脉高压的主要原因，其源自临床病理事件，如肺部慢性阻塞性肺疾病、阻塞性睡眠呼吸暂停综合症，以及环境挑战，比如高海拔暴露。同时，在肺动脉高压时，动脉氧分压降低进一步促进了肺动脉高压的进展。长时间暴露于肺泡缺氧会导致肺血管重塑，进而导致肺血管阻力和心输出量的增加，从而导致预后不良，死亡风险显著增加。
然而，肺动脉系统如何响应持续性缺氧压力的机制仍不清楚，尽管诱导的HIF（缺氧诱导因子）信号在相对早期的缺氧阶段起着血管反应的作用。从细胞角度来看，线粒体稳态成为异常氧气张力的主要承受者，考虑到线粒体在氧气感应和消耗中的关键作用。已经充分证实，线粒体功能障碍会导致心血管细胞，包括心肌细胞、血管平滑肌细胞和血管周围脂肪细胞中的细胞过程停滞，这些细胞在细胞质中含有高水平的线粒体（占细胞质体积的30%–35%），为满足细胞活动的高能量需求提供ATP。然而，非同寻常的情况表现在内皮细胞（ECs）中，其中线粒体仅占细胞质体积的2%到6%。此外，血管ECs中的ATP主要来自无氧糖酵解，而不是线粒体氧化磷酸化。已有猜测称内皮细胞的线粒体可能作为信号中心而不是分子燃料站。人们越来越重视内皮细胞线粒体在心血管发育和功能维护中的重要性。但是，在血管稳态中，除了作为ATP生产者的功能外，内皮细胞线粒体的功能机制仍然不清楚。
作为血管壁的最内层，内皮是感知和响应血管内的血流动力学、体液和缺氧刺激的前线。此外，ECs会将反应性信号传递给血管壁的中膜和外膜。因此，内皮功能障碍是大多数血管重塑和疾病的常见初始事件。因此，缺氧介导的内皮功能障碍被认为是缺氧引起的血管重塑在肺动脉高压和其他缺氧性血管疾病中的主要原因。适应缺氧会触发内皮线粒体的再分布和移动，体现为一种动态行为，即线粒体分裂和融合之间的平衡，这由一组线粒体动态蛋白质控制。迄今为止，线粒体分裂1蛋白质（FIS1 [线粒体分裂1]）、DRP1（动态蛋白相关蛋白1）和MFF（线粒体分裂因子）已被鉴定为线粒体分裂的主要调节因子，而线粒体融合蛋白质（MFN1 [线粒体融合素1] 和MFN2）以及OPA1（视神经萎缩蛋白1）参与了哺乳动物细胞的线粒体融合。值得注意的是，DRP1和DRP1-FIS1相互作用被认为在心室肌细胞和心室纤维母细胞的功能障碍以及肺动脉平滑肌细胞的功能障碍中发挥重要作用。有趣的是，最近的研究发现FIS1在哺乳动物细胞中是驱动线粒体分裂的力量，不仅通过介导DRP1依赖的线粒体分裂，还通过以DRP1独立的方式与其他线粒体蛋白质相结合和介导来发挥作用。线粒体的可塑性还指的是线粒体与其他细胞器甚至亚细胞器重塑之间的通讯。在这方面，线粒体重塑的病理生理功能可能是内皮细胞线粒体的调节作用的关键点。值得注意的是，以前的临床和动物研究表明，缺氧缺血应激会增加脑和心脏血管系统中SUMO（小泛素样调节子）共轭的水平，这些蛋白质在线粒体内有显著的定位，提示SUMOylation在线粒体中在相关的血管病变中可能发挥作用。SUMOylation是一种新识别的翻译后修饰，由于其在真核细胞中不可或缺的调节功能，已经引起了越来越多的关注。与此对应，SUMOylation底物的列表已经扩展到包括比起最初的核蛋白质类别更多的分子，在细胞质和质膜内涵盖目标。生物化学上，SUMO分子在E1/E2/E3酶和SENP（sentrin-specific protease）的控制下被动态共轭到和从目标蛋白质上解离。因此，一系列SUMO化蛋白质的特性可以受到影响，包括但不限于活性、亚细胞定位和稳定性。在哺乳动物细胞中，SENP介导的去SUMO化在维持生理功能中发挥重要作用。除了在细胞核中具有优势定位外，SENP1还在胞质中广泛转位，以去SUMO化许多胞质蛋白质，表明SENP1介导的去SUMO化在核外亚细胞结构中起作用。最近，SUMOylation的病理生理功能与主要疾病相关，包括患者和动物模型中的心血管系统障碍。之前的数据显示SENP1介导的去SUMO化在缺血和血管缺陷中的作用，并且研究还揭示了SUMOylation在移植性动脉硬化中的内皮激活以及在血管生成中的内皮生长中的关键作用。在本研究中，揭示了内皮线粒体内部的SUMOylation介导的线粒体稳态的调控，以在PH期间对缺氧应激的响应中保护肺内皮功能。
研究方法：
采用慢性缺氧小鼠模型和Sugen/缺氧大鼠模型作为PH动物模型。线粒体形态和亚细胞结构通过透射电子和免疫荧光显微镜确定。线粒体代谢通过线粒体耗氧速率和细胞外酸化率确定。通过免疫沉淀确定SUMOylation和蛋白质相互作用。
研究结果：
为了探索在肺动脉高压（PH）期间调节内皮线粒体的线索，研究收集了由慢性阻塞性肺疾病引起的PH患者的肺组织，以及非PH肺组织，进行了透射电子显微镜（TEM）和组织学检查。 在临床缺氧相关PH标本中，发现了SENP1（sentrin-specific protease 1）介导的SUMOylation与肺内皮线粒体重塑的关联，并在低氧条件下的人肺动脉内皮细胞中得到验证。
图1. 在肺动脉高压（PH）期间，SENP1（特异性蛋白酶1）介导的SUMOylation参与了缺氧条件下肺内皮细胞线粒体形态重塑。
为了说明内皮线粒体形态中SENP介导的SUMOylation的生化功能，尤其是前文提到的线粒体分裂表型，使用基于计算机系统的软件和免疫共沉淀分析内源性SUMO连接到线粒体分裂/融合蛋白上。
图2. SENP1（特异性蛋白酶1）调节FIS1（线粒体分裂1）的SUMOylation。
为了解析SENP1介导的FIS1 SUMOylation在低氧性肺动脉高压中内皮线粒体形态的功能机制，根据患有中度肺动脉高压（中度PH）和严重肺动脉高压（严重PH）的患者的临床特征，研究对来自非PH供体、中度PH患者和严重PH患者的HPAECs中的FIS1 SUMOylation进行了检查。
图3. 低氧条件下，通过将SENP1（特异性蛋白酶1）转移到线粒体中，增强了FIS1（线粒体分裂1）的去SUMO化作用，在肺内皮细胞中发生。
为了进一步探索FIS1在内皮细胞线粒体动态和MAM形成中的作用机制，考虑到融合蛋白，尤其是MFN2，在相关的细胞器重塑中的关键作用，研究了FIS1与线粒体融合蛋白之间的相互作用。
在临床标本、低氧大鼠和小鼠PH模型、人肺动脉内皮细胞以及人胚胎干细胞衍生内皮细胞中进一步分析揭示，短时缺氧诱导SENP1转位到内皮线粒体，调节线粒体分裂蛋白FIS1（线粒体分裂1）的去SUMO化，进而促进FIS1与融合蛋白MFN2（线粒体融合蛋白2）以及线粒体通道门控蛋白VDAC1（电压依赖性阳离子通道1）的组装，通过增强MFN2的寡聚化来增强其膜连接活性。
图4. FIS1（线粒体分裂1）的去SUMO化通过与MFN2（线粒体融合蛋白2）结合促进了与线粒体关联膜的形成。
MAM的最重要作用是促进内质网和线粒体之间的钙交换。有趣的是，研究基于质谱的蛋白质组学分析发现，去SUMO化的FIS1形式（FIS1-KR）与更多与MAM相关的蛋白质，包括VDAC1，有着更加强化的关联。VDAC1在构成MAM结构和调节线粒体钙摄取中起着关键作用。确实，共免疫沉淀实验显示，在表达FIS1-KR的HPAECs中，FIS1与VDAC1之间的关联增加，在短期暴露于缺氧的HPAECs中也增加，而在SENP1敲除的HPAECs中则减少。这些发现表明，SENP1调节的FIS1的SUMO化可能参与调控线粒体钙摄取。因此，在敲除内源性FIS1后，测量了HPAECs中FIS1-WT和FIS1-KR重表达后的线粒体（[Ca2+]mito）、内质网（[Ca2+]ER）和细胞质（[Ca2+]cyto）中的Ca2+水平。
图5. FIS1（线粒体分裂1）的去SUMO化维持Ca2+平衡并保护线粒体功能。
为了进一步确定内皮FIS1的SUMOylation/deSUMOylation在缺氧性肺动脉高压病理发生中的调节作用，在大鼠中构建了Sugen/缺氧性肺动脉高压模型和慢性缺氧性肺动脉高压模型。大鼠分为四周的正常氧气处理组（对照组）、四周的单纯缺氧处理组（缺氧组）以及四周的缺氧处理并伴随一次注射SU5416的组（Sugen/缺氧组）。与研究在临床标本中的发现一致，免疫沉淀实验显示，与正常氧气对照组相比，在缺氧组大鼠的肺动脉内皮细胞中，FIS1的SUMOylation减少，而在Sugen/缺氧组大鼠的肺动脉内皮细胞中，FIS1的SUMOylation增强。
图 6. 在慢性缺氧和Sugen/缺氧大鼠模型中，肺内皮细胞中的SENP1（特异性sentrin蛋白酶1）介导的FIS1（线粒体分裂1）的SUMO化在肺动脉高压（PH）过程中发挥关键作用。
为了进一步验证这一点，研究构建了内皮细胞特异性的SUMO-FIS1敲入小鼠（SUMO-FIS1-ecKI小鼠）和FIS1-WT小鼠（FIS1-ecKI小鼠；图S8B和S8C）。在经过四周的缺氧暴露后，SUMO-FIS1-ecKI小鼠在缺氧性肺血管重塑方面呈现出更为广泛的趋势，肺动脉中层厚度显著增加，而且PH加剧，表现为右室收缩压显著增加和富尔顿指数增强，与FIS1-ecKI小鼠的测量值相比。
图 7. 过多的内皮FIS1（线粒体分裂1）-SUMO（小泛素样修饰物）结合加剧了缺氧诱导的肺动脉高压的发展。
根据在PH临床样本、大鼠和小鼠的缺氧性PH观察以及体外发现，FIS1的去SUMOylation通过维持线粒体稳态，在缺氧应激下保护肺内皮细胞功能，研究提出内皮细胞中FIS1的去SUMOylation在缺氧性肺血管重塑和缺氧诱导的PH中发挥保护作用。为此，在缺氧性暴露后1周，研究通过气道内滴注将编码FIS1-WT（AAV-FIS1-WT）或FIS1-KR（AAV-FIS1-KR）的2种靶向内皮细胞的腺相关病毒（AAV）载体引入小鼠体内，用于诱导PH。与体内结果一致，肺组织中的TEM检查显示，在经过1周的缺氧性暴露后，接受AAV-FIS1-WT治疗的小鼠出现了内皮细胞线粒体分裂，而AAV-FIS1-KR组则没有，并且AAV-FIS1-KR组中的线粒体AR、FF和平均面积增加。
图8. 引入去SUMO化的FIS1（线粒体分裂1）有助于缓解缺氧诱导的肺动脉高压的发展。
FIS1的去SUMO化维持了线粒体完整性，以及线粒体相关膜上的内质网-线粒体钙通信，从而保持肺内皮细胞功能和血管稳态。相反，长时缺氧通过通过诱导miR-138减少线粒体中SENP1的可用性，从而破坏了FIS1的去SUMO化，进而导致肺内皮线粒体功能障碍和代谢重编程。功能上，将去SUMO化的FIS1引入小鼠肺内皮细胞中，改善了肺内皮细胞功能障碍和低氧PH的发展，而将SUMO连接的FIS1引入小鼠则加重了疾病细胞和组织表型。
研究结论：
通过维持内皮线粒体稳态，FIS1的去SUMO化适应性地保护了肺内皮细胞免受缺氧应激的影响，从而保护免受PH的损害。在肺内皮细胞中，FIS1的去SUMO化-SUMO化转变是缺氧性PH的内在病理机制。
研究启示：
缺氧被认为是导致和促进肺动脉高压的诱因和推动因素，肺动脉高压是一种常见的心血管疾病，预后不良且病死率高。内皮线粒体被认为是信号体而不是能量供应体，因为它们在内皮细胞中的含量较低且在能量供应中占据次要位置。在肺动脉高压发展过程中，肺动脉系统如何对缺氧应激作出响应的机制尚未完全理解。
去SUMO化的FIS1（线粒体分裂1）维持肺动脉内皮功能，因而通过维持内皮线粒体稳态预防（或抑制替代）缺氧诱导的肺动脉高压。持续的缺氧通过减少线粒体中去SUMO化酶SENP1（sentrin-specific protease 1）的可用性，从而使FIS1的去SUMO化失效，进而使线粒体动态平衡偏向过度分裂/碎片化，并由于肺血管内皮细胞中FIS1的过度SUMO化，破坏了线粒体相关膜上的内质网-线粒体钙通信。SENP1介导的FIS1去SUMO化-SUMO化转变调节了肺血管内皮在缺氧时的代谢转变，与缺氧持续时间相符，从而对肺动脉高压的发病机制起到关键作用。
本文提供了哪些新信息？
肺动脉高压的特点是肺动脉内血压升高，导致心脏功能障碍，预后不良且病死率高。在病因因素中，缺氧被认为是导致和促进该疾病的因素。然而，肺动脉系统如何对肺动脉高压的发展过程中的缺氧应激作出响应的机制尚不完全清楚。本研究确定了一种高度动态的翻译后修饰——SUMOylation，在肺血管内皮细胞中的线粒体形态变化中的参与。短期缺氧引发了去SUMO化酶SENP1到线粒体的转位，SENP1在此处通过针对线粒体分裂蛋白FIS1来调节线粒体的重塑。SENP1介导的FIS1去SUMO化促进了FIS1与线粒体融合蛋白MFN2（mitofusin 2）和线粒体门控蛋白VDAC1（voltage-dependent anion channel 1）的组装，从而维持了线粒体完整性、线粒体相关膜的形成和细胞内钙平衡。持续的缺氧使得肺血管内皮细胞中线粒体的SENP1缺失，使线粒体动态平衡向过度分裂/碎片化倾斜，破坏了线粒体相关膜结构，由于FIS1的过度SUMO化。由此引发的线粒体功能障碍和细胞代谢重编程导致肺内皮功能障碍和肺动脉高压的进展。肺血管内皮中FIS1去SUMO化-SUMO化转变与缺氧持续时间一致，是肺动脉高压的内在发病因素之一。
参考文献：
Zhou X, Jiang Y, Wang Y, Fan L, Zhu Y, Chen Y, Wang Y, Zhu Y, Wang H, Pan Z, Li Z, Zhu X, Ren R, Ge Z, Lai D, Lai EY, Chen T, Wang K, Liang P, Qin L, Liu C, Qiu C, Simons M, Yu L. Endothelial FIS1 DeSUMOylation Protects Against Hypoxic Pulmonary Hypertension. Circ Res. 2023 Aug 17. doi: 10.1161/CIRCRESAHA.122.321200. Epub ahead of print. PMID: 37589160.
转自：“肺动脉高压研究进展”微信公众号
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