动态水凝胶引起了骨组织工程的巨大兴趣，因为与传统的静态水凝胶相比，它们表现出可逆力学，可以更好地模拟天然细胞外基质(ECM)的生物物理线索。然而，轻松开发治疗性动态水凝胶，同时再现活组织ECM的丝状结构，并诱导成骨和血管生成以增强血管化骨再生，仍然具有挑战性。在此，华南理工大学王迎军&陈云华团队报道了一种双纳米工程DNA动态水凝胶，该水凝胶是通过淀粉样原纤维和粘土纳米片与DNA链的超分子共组装而开发的。纳米工程ECM样纤维水凝胶网络很容易形成，无需复杂而繁琐的分子合成。淀粉样原纤维与粘土纳米片一起协同增强动态水凝胶的机械强度和稳定性，更显着的是，赋予基质一系列可调节的特性，包括剪切稀化、可注射性、自修复、自支撑和可3D打印特性。QK肽进一步化学接枝到淀粉样原纤维上，其从水凝胶基质中的可持续释放刺激人脐静脉内皮细胞的管形成和迁移。同时，纳米工程水凝胶基质由于来自粘土纳米片的Si4+和Mg2+的可持续释放而促进骨髓间充质干细胞的成骨分化。此外，在大鼠颅骨缺损模型中揭示了通过动态水凝胶增强血管化骨再生的操作。这种双重纳米工程策略在开发治疗性动态水凝胶以改善和可定制的骨再生方面前景广阔。该研究以题为“Amyloid Fibril and Clay Nanosheet Dual-Nanoengineered DNA Dynamic Hydrogel for Vascularized Bone Regeneration”的论文发表在《ACS Nano》上。
该研究将基于静电和氢键相互作用的淀粉样原纤维和粘土纳米片与DNA链的超分子共组装来开发双纳米工程DNA水凝胶(称为DAC)。这种制造策略具有无需复杂繁琐的分子合成即可制备类ECM纤维状水凝胶网络的优点。具有高长径比的淀粉样原纤维(AF)和DNA相互作用的粘土纳米片可以协同增强复合水凝胶的机械强度和稳定性。
方案 1. 用于血管化骨再生的双纳米工程自组装DAC水凝胶的制备
【淀粉样原纤维、粘土纳米片与DNA链的物理相互作用】
该研究首先通过将10 wt%溶菌酶溶液在pH 2.0下加热10小时来合成淀粉样原纤维(AF)。纳米原纤维具有高纵横比，平均直径为51 ± 2 nm长度可达1−10 μm。AF可作为有效的机械性能增强剂。AF的带正电表面能够与带负电的DNA链和粘土纳米片表面形成静电相互作用。
图1. AF、粘土纳米片和DNA的物理结合
【具有机械增强作用的动态水凝胶形成】
将淀粉样原纤维(AF)和粘土纳米片注入DNA水凝胶基质中可以协同增强动态交联网络。通过振荡流变分析研究了掺有AF和粘土纳米片的DNA水凝胶的机械性能。结果表明AF和粘土纳米片都可以增强DNA水凝胶的机械性能。此外，DNA和DAC水凝胶都可以经历多个应变循环，储能模量可以在几秒钟内完全恢复，证明了物理交联网络的自愈能力。这些结果可能归因于 AF、粘土纳米片和 DNA 链之间的动态和可逆氢键和静电相互作用。为了进一步测试DAC水凝胶的自愈能力，将所制备的水凝胶进行切割并用外力沿切割表面附着。结果表明，37℃时愈合效果更好，实现机械恢复所需的时间更少。将在不同时间和温度下愈合的水凝胶浸入PBS中1天和2天，这些水凝胶没有崩解。DAC水凝胶的自愈特性可能会延长其使用寿命。
图 2. DAC动态水凝胶的流变学和自愈特性
【DAC水凝胶的剪切稀化、3D打印特性和结构表征】
可逆氢键和静电相互作用可以赋予DAC水凝胶剪切稀化和可注射特性。DAC水凝胶的粘度随着剪切速率的增加而降低，揭示了它们的剪切稀化特征。值得注意的是，通过挤出3D打印可以制造更复杂和专用的水凝胶骨架，这表明DAC水凝胶具有良好的打印性能。3D 打印的DAC1.0水凝胶支架表现出良好的稳定性，在不同pH值的PBS中7天没有明显的膨胀或崩解，表明其具有耐受体内伤口微酸性微环境的潜力。
图 3. DAC水凝胶的3D打印适性、成型性和稳定性
【AF上QK肽接枝及其生物活性】
基于其表面高度重复排列的带电/不带电残基，淀粉样原纤维能够以共价和非共价方式结合多种分子/生物分子，包括蛋白质、DNA/RNA、生物膜和小分子，这有利于药物装载，实现多模式协同治疗。血管生成QK肽可以通过化学反应将接枝到AF上，并与DAC的制备类似地构建DAC-QK水凝胶。此外，与DA水凝胶中的QK释放相比，AF-QK的释放相对较慢，表明AF-QK的释放受到AF-QK与DNA和粘土纳米片相互作用的影响；因此，达到了一定的缓释效果，可用于缓解QK释放。
该研究还通过活/死染色荧光成像测试DAC水凝胶对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)活力和增殖的影响。结果表明，与对照组相比，水凝胶具有良好的生物相容性，并且水凝胶组对HUVECs增殖行为具有积极的调节作用。此外，从水凝胶中释放的AF-QK可以增强细胞的迁移，表明释放的AF-QK保留了其高生物活性。
图 4. DAC水凝胶的AF-QK传递和HUVEC迁移调节
【DAC-QK水凝胶增强体外血管生成】
HUVECs的血管化性能是通过其体外管形成能力评估的。在对照组和无AF-QK组中很难观察到管的形成。相比之下，大多数参与管形成的HUVECs存在于DA-QK和DAC1.0-QK 组中。表明水凝胶组装与AF-QK配合可有效增强体外HUVECs管的形成。不仅如此，AF-QK和DNA水凝胶的结合提供了更有利于HUVECs血管生成的环境基质。
图 5. 水凝胶刺激的HUVEC血管生成评估
【DAC水凝胶增强体外成骨】
有必要评估添加粘土纳米片的DAC水凝胶的成骨细胞活性，以通过释放Si4+、Mg2+和Li+ 离子进一步增强成骨作用。首先测试了这些离子从DAC1.0水凝胶中释放7天的曲线。整个释放期间初始释放量较高，并且在第五天之后释放量趋于达到平衡。然后通过活-死活力和CCK-8测定评估DAC水凝胶对骨间充质干细胞(BMSC)活力和增殖的影响。结果表明，不同AF浓度的DA水凝胶具有良好的生物相容性并支持细胞增殖。此外，DNA水凝胶中添加的AF和粘土纳米片在刺激BMSC的成骨细胞反应方面具有强大的协同作用，无需任何成骨生长因子。不仅如此，在没有任何骨诱导因子的情况下，含有粘土纳米片的DAC水凝胶可以有效促进ALP活性的上调。
图 6. 水凝胶提取物刺激BMSC的成骨分化
【DAC-QK水凝胶骨再生的体内评价】
该研究进一步将DAC-QK水凝胶转化为SD大鼠的临界尺寸颅骨缺损模型，以评估血管化骨再生。结果表明，AF-QK能有效促进骨缺损区早期血管化，为骨组织再生提供必需的营养物质，同时代谢废物，发挥骨与邻近组织之间的通讯网络功能，进一步协同增强骨组织再生能力。粘土纳米片对骨组织再生的促进作用。
图 7. DAC-QK水凝胶在构建的大鼠颅骨缺损模型中增强新骨再生
此外，为了分析骨化程度，采用免疫组织化学方法评估骨缺损区域中成骨标志物OCN、血管化标志物CD31和VEGF的表达。结果表明AF-QK和粘土纳米片可以协同增强成骨蛋白的表达，即AF-QK和粘土纳米片协同促进成骨蛋白和血管化标志物的表达。
图 8. 代表性免疫组织化学图像
【小结】
该研究展示了一种双纳米工程动态水凝胶，可以重现ECM的纤维结构，同时促进血管生成和骨生成，从而增强骨再生。基于淀粉样原纤维和粘土纳米片与带负电荷的DNA磷酸链的静电相互作用，水凝胶的物理和机械性能得到有效增强，例如令人着迷的自修复性、可注射性、可成型性和3D打印性能。配制的纳米工程水凝胶还具有血管生成作用，能够持续释放 AF-QK，并通过包含粘土纳米片并释放Si4+和Mg2+离子来促进成骨分化。该研究进一步证明，粘土纳米片与DAC水凝胶传递的AF-QK一起存在可以协同刺激成骨和血管生成，从而增强大鼠骨缺损的骨愈合。这些发现非常令人鼓舞，可以为开发动态纳米纤维水凝胶材料以增强骨组织再生提供灵感。
来源：BioMed科技
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